Формирование ук проводки: Внесение уставного капитала на расчетный счет

1С Бухгалтерия 8.3: Формирование уставного капитала

Проводки по формированию уставного капитала организации бухгалтер должен оформить датой регистрации фирмы.

После оформления распечатывается начальная сальдовая ведомость и подкладывается к учредительным документам. Минимальные размеры уставного капитала нам диктует Гражданский кодекс РФ. Уставный капитал должен быть внесен учредителем в течение 4 месяцев. Оценка неденежных вкладов учредителей обязательна, но в некоторых случаях допускается согласованная учредителями оценка.

Первый этап работы: формирование Уставного капитала в программе 1С:

 

/Операции/ — /Бухгалтерский учет/ — /Операции введенные вручную/- кнопка «Создать» — Операцию

В табличнй части открывшегося документа с помощью кнопки «Добавить» необходимо сформировать проводку по каждому учредителю:

Дт 75.01  Кт 80 — на сумму заявленную в Уставе

 Сохраняет документ с помощью кнопки

«Провести и закрыть»

В результате у фирмы появляется дебиторская задолженность учредителей и в пассиве Уставный капитал.

 

Второй этап работы: Внесение уставного капитала учредителями.

1. Если УК вносится денежными средствами:

1.1 Безналично на расчетный счет- /Банк и касса/ — /Банк/ -/Банковские выписки/ — нажимаем командную кнопку «Поступление»

 

Заполняем документ как показано на примере, в результате проведения сформируется проводка:

Дт 51 Кт 75.02 на сумму поступившего вклада в Уставный капитал

1.2 Наличными, в кассу организации: /Банк и касса/ — /Касса/ -/Кассовые документы/ — нажимаем командную кнопку «Поступление»

 

Заполняем документ как показано на примере, в результате проведения сформируется проводка:

Дт 50.

01 Кт 75.02 на сумму поступившего вклада в Уставный капитал

2. Если УК вносят материалами, товарами, оборудованием 

 /Покупки/ — /Поступление(акты, накладные)/ — нажимаем командную кнопку «Поступление» и выбираем категорию ТМЦ.

Заполняем документ как показано на примере, в результате проведения сформируется проводка:

Дт 41 (10,08)  Кт 75.02 на сумму оценочной стоимости поступившего вклада в Уставный капитал

Научим работать в программе 1С Бухгалтерия 8.3 на курсах в УЦ ПрофиРост!

Связанный курс

Бухгалтерский и налоговый учет для новичков + 1С:Бухгалтерия 8.3

Узнать подробнее

/ «Бухгалтерская энциклопедия «Профироста»
16.07.2017

1С Бухгалтерия предприятия – формирование уставного капитала организации

Содержание:

1.       Формирование уставного капитала организации

2.       Изменение уставного капитала

3.       Выплата дивидендов учредителям

      

В конфигурации 1С:Бухгалтерия предприятия 3.0 (3.0.73.54) частично автоматизированы операции по учету уставного капитала в 1С, существует документ «Формирование уставного капитала» и «Начисления дивидендов». 

1.      Формирование уставного капитала организации

В бухгалтерском учете формирование уставного капитала организации отражается проводками:

Дебет 75 Кредит 80

В БП 3.0 субконто Учредители является составным. Тип значения этого субконто можно выбрать как из справочника Контрагенты, так и из справочника Физические лица.

Меню: Операции – Подраздел «Бухгалтерский учет» — «Формирование уставного капитала»

В шапке документа указывается дата и организация, по которой регистрируется хозяйственная операция.

В табличной части указывается список учредителей и сумма взноса каждого из них в уставной капитал. Учредители выбираются соответственно из справочника «Контрагенты» либо справочника «Физические лица».

Рассмотрим движения этого документа:

На счете 75.01 фиксируется дебиторская задолженность учредителей по взносам перед организацией.

Далее следует отразить непосредственно сам взнос учредителей в уставной капитал в виде наличных или безналичных денежных средств.

Дебет 50 Кредит 75.01

В случае взноса наличными следует ввести документ Приходный кассовый ордер с типом операции «Прочий приход».

Счет кредита устанавливаем «75.01» и указываем соответствующего учредителя.

Аналогично оформляются безналичные взносы:

Меню: Банк и касса – подраздел «Банк» — Банковские выписки – кнопка «Поступление». В документе указываем вид операции «Прочее поступление», счет расчетов «75.01» и соответствующего учредителя.

 

Также вклад в уставной капитал, внесенный учредителями может быть внесен имуществом: основными средствами, материалами, товарам, НМА.

Для этих видов операций можно воспользоваться типовыми документами: Поступление основных средств, Поступение (акты, накладные), указав счет расчетов с поставщиком: 75.01. При этом придется вручную скорректировать проводку по счету 75.01, так как субконто Учредители не заполняется. Либо отразить эти операции с помощью документа «Операции, введенные вручную». 

2.      Изменение уставного капитала

В случае если учредители вносят дополнительные инвестиции либо в число учредителей принимаются новые лица, важно зафиксировать изменения уставного капитала.

В бухгалтерском учете это отражается вышеописанной проводкой

Дебет 75.01 Кредит 80

ВАЖНО! При заполнении документа «Формирование уставного капитала» в этом случае нужно в табличную часть внести не только данные о новом учредителе и размере его вклада (или сумму инвестиции какого-либо учредителя), но и отразить имеющихся учредителей и соответствующие суммы взносов, как бы «заново» формируя уставный капитал.

Еще один вариант увеличения уставного капитала – использование части нераспределенной прибыли. Сумма увеличения размера доли каждого учредителя рассчитывается исходя из процента уставного капитала, которым владеет данный учредитель. В бухгалтерском учете по каждому из учредителей фиксируется проводка :Дт 84 Кт 80. Либо Дт 83 (добавочный капитал) Кт 84, если учредители принимают решение о списании добавочного капитала для увеличения уставного.

При выходе учредителя из капитала организации ему полагается вернуть долю, которую он внес.

Дебет 80 Кредит 75.01

И далее выплатить эту долю в форме наличного (расходный кассовый ордер) либо безналичного платежа (Списание с расчетного счета), либо в иной форме.

Если чистые активы предприятия меньше размера уставного капитала, то по закону уставной капитал должен быть сокращен до размера чистых активов. Процент доли каждого учредителя остается неизменным, сумма уменьшения размера доли каждого учредителя рассчитывается пропорционально вкладу в уставной капитал.

Дебет 80 Кредит 84  

3.      Выплата дивидендов учредителям

Учредители могу принять решение о выплате дивидендов учредителям в случае, если по итогам года организация имеет чистую прибыль. В программе 1С:Бухгалтерия предприятия можно воспользоваться документом «Начисление дивидендов».

Меню: Операции – подраздел «Бухгалтерский учет».

Документ оформляется по каждому учредителю. В случае если учредитель является физическим лицом, то с него следует удержать НДФЛ, если юридическим – налог на прибыль юридических лиц.

Работа с проводками документа:

Дебет 84.01        Кредит 75.02

Дебет 75.02        Кредит 68.01

Специалист компании ООО «Кодерлайн» 

Татьяна Федорова.

Как отражается в бухгалтерском учете формирование уставного капитала в иностранной валюте ?

ID вопроса: 2102

Размер Уставного фонда — 67 000 000 сум, В уставе написано, что из 67 000 000 сум 11 000 000 сум надо внести наличными на расчетный счет предприятия, 20000$ долларов США по курсу 2800 сум = 56 000 000 сум надо внести на валютный счет предприятие в долларах США (хотя надо было указать курс ЦБ). Бухгалтер дал проводки: 1. Отражение уставного капитала в бухгалтерском учете: ДТ: 46 10 — 20000*2800 = 56 000 000 сум ДТ: 46 20 — 11 000 000 сум КТ: 83 10 — 67 000 000 сум 2. Внесение уставного капитала на расчетный счет: ДТ: 51 10 — 11 000 000 сум КТ: 46 10 — 11 000 000 сум ДТ: 52 10 — 20000 долларов США по курсу ЦБ — 2 276,19 сум КТ: 46 20 — 20000 долларов США по курсу ЦБ — 2 276,19 сум Таким образом на 46 20 осталась курсовая разница от формирование Уставного капитала на сумму — 10 476 200 сум. Бухгалтер на эту сумму дал нижеследующую проводку: ДТ: 84 20 — 10 476 200 сум КТ: 46 20 — 10 476 200 сум Предприятие хочет получить кредит, но сотрудники банка утверждают что проводки были неправильные и что учредитель должен внести на расчетный счет курсовую разницу как добавленный капитал или исправить устав. Но в хокимияте говорят, что 11 000 000 сум и 20000 долларов США внесены и устав полностью сформирован никаких оснований нет для изменения устава.

1. Правильно ли выполнены проводки ? 2. Закономерно ли утверждение банка? 3.Что должен сделать бухгалтер, чтобы все операции правильно отобразить в бухгалтерском учете?

Как отражается в бухгалтерском учете формирование уставного капитала в иностранной валюте ?

Ответы экспертов:

Полный текст доступен пользователям, выполнившим вход на сайт

Войдите под своей учетной записью или зарегистрируйтесь.

Полный текст доступен пользователям, выполнившим вход на сайт

Войдите под своей учетной записью или зарегистрируйтесь.

Вы можете использовать свою учетную запись сайта norma.uz. Если у вас нет учетной записи, зарегистрируйтесь.

Руководство по сбору Папы Фонда контроля

: Найдите эти удостоверения личности!

Теперь доступно расширение Control Foundation , и это руководство послужит пошаговым руководством для его миссии Pope’s Collection .

Вы получите задание, поговорив с Эмили Поуп после того, как она войдет в зону Crossroads . Она даст вам отмычку и скажет искать пять (5) удостоверений личности на складе .

Найдите 5 удостоверений личности

Все пять удостоверений личности находятся на складе, а именно:

1. На двухъярусной кровати в желтом здании, наиболее удаленном от контрольной точки склада
2. На столе в желтом здании наверху рампы возле контрольной точки
3. Из №2, на строительных лесах за углом
4. В коридоре после использования трех кристаллических платформ, чтобы попасть в единое целое в большой колонне
5. В лифтовом помещении в задней части колонны (цокольный этаж)

Наш видеогид, расположенный ниже, при необходимости покажет вам все места. Когда все пять найдены, самое время правильно их разместить и отправиться в лабораторию.

Пазл для размещения ID-карты

Карты нужно вставлять в следующем порядке:

Из задней части комнаты (напротив входящей двери):

• Карточка начальника службы безопасности : Вблизи справа (пистолет на столе)
• Карточка ведущего физика : Крайний справа (Колыбель Ньютона на столе)
• Начальник отдела Карточка исследования : Дальняя стена, возле двери (одинокая станция с фотографией исследователей)
• Карточка главного инженера раскопок : Крайний слева (кирка на столе)
• Карточка старшего картографа : Вблизи слева (карты на столе)

Размещение карт в правильном порядке предоставит вам доступ к лифту на этаж 0 .

Гиббс и секретная лаборатория

Спуститесь в лабораторию и будьте готовы к битве с злодеем по имени Гиббс . Вот наши советы:

• Будьте агрессивны, стреляйте в него всем, чем можете.
• Он будет периодически прятаться в задних углах лаборатории; когда это произойдет, будьте готовы к встрече с плебсами.
• Гиббс выстрелит в вас красным лучом света, который нанесет огромный урон; либо используйте лабораторию, чтобы заблокировать луч, либо вместо этого поднимите Shield .

Держитесь за него, и он быстро спустится, позволяя вам забрать документы в задней части лаборатории. Оттуда возвращайтесь к Pope , чтобы завершить миссию.

Видеогид

Лучше работать с видео? Сделано легко!

Control Foundation теперь доступен на ПК с Windows и PS4; он отправится на Xbox One в июне.

Эта статья может содержать партнерские ссылки, что означает, что мы можем заработать небольшую комиссию, если вы перейдете по ссылке и сделаете покупку.Stevivor — независимое издание, и на нашу журналистику никоим образом не влияют рекламодатели или коммерческие инициативы.

CARD играет решающую роль в формировании очагов ASC и передаче сигналов инфламмасом.

Abstract

Пятнистый белок, ассоциированный с апоптозом (ASC), является ключевым компонентом мультимерных белковых комплексов, которые опосредуют воспаление и защиту хозяина. Состоящий из домена пирина (PYD) и домена активации и рекрутирования каспаз (CARD), ASC функционирует ниже нуклеотид-связывающего домена, рецепторов, содержащих богатые лейцином повторы (NLR), и отсутствует в меланоме 2 (AIM2) за счет образования супрамолекулярных структуры, названные инфламмасомами.Однако механизм, лежащий в основе передачи сигналов ASC и его зависимость от расположения олигомеров в образовании инфламмасом, остаются плохо изученными. При экспрессии в клетках ASC образует дискретные очаги (называемые «пятнышками»), как правило, по одному пятнышку на клетку. Мы использовали систему бимолекулярной флуоресценции (BiFC) для исследования и визуализации формирования очагов ASC в живых клетках. Мы демонстрируем, что CARD ASC играет центральную роль в сборке инфламмасом ASC, представляя минимальную единицу, способную образовывать фокусы вместе с Caspase-1 CARD.Мутационные исследования указывают на множественные поверхности на ASC CARD и две преобладающие области на Caspase-1 CARD, опосредующие формирование очагов ASC / Caspase-1. Отсутствие очагов у мутантов ASC CARD коррелирует с потерей процессинга IL-1β в ответ на агонисты NLRP3 или AIM2 в анализах восстановления клеток RAW264.7. Аналогично, мы показываем, что продуктивное образование индуцированной Salmonella typhimurium инфламмасомы NLRC4 зависит от ASC-CARD-опосредованного образования платформы. Таким образом, наши результаты отражают центральную роль CARD в формировании сигнальных платформ ASC и предоставляют важный инструмент для исследования CARD-зависимых сетей.

Ключевые слова: формирование сигнальной платформы, домены смерти, инфламмасома, CARD, врожденный иммунитет, каспаза-1, воспалительные цитокины, Nod-подобные рецепторы (NLR), NLRC4, Salmonella

ВВЕДЕНИЕ

Врожденный иммунитет включает первое линия защиты от вторжения патогенов. Врожденный иммунный ответ инициируется Toll-подобными рецепторами (TLR), NLR и другими сенсорами, такими как AIM2, которые распознают молекулярные паттерны, ассоциированные с патогенами (PAMP) и повреждают ассоциированные молекулярные паттерны (DAMP).Члены семейства NLR являются мощными индукторами ключевых защитных путей, включая инициацию ответа NF-κB, активацию воспалительных каспаз и высвобождение провоспалительных цитокинов [1, 2]. Отсутствие правильной передачи сигналов NLR приводит к различным аутоиммунным нарушениям, включая болезнь Крона (NOD2) [3], синдром Блау (NOD2) [4], витилиго (NLRP1) [5, 6], синдром Макл-Уэллса (NLRP3) [7], мультисистемное воспалительное заболевание с неонатальным началом (NOMID) (NLRP3) [8] и семейный холодовый аутовоспалительный синдром (NLRP3) [7, 9].

Адаптер апоптозного спек-подобного белка (ASC) представляет собой центральное звено между NLR / AIM2 и их нижестоящей сигнальной мишенью Caspase-1. Его двудольная архитектура Pyrin-CARD позволяет ASC одновременно взаимодействовать с пириновым доменом (PYD) NLR / AIM2 и CARD каспазы-1, что в конечном итоге приводит к процессингу воспалительных цитокинов, таких как pro-IL-1γ и pro-IL- 18 [10]. Активация каспазы-1 сильно зависит от образования высокоолигомерных ASC-зависимых структур, обычно называемых фокусами [11].Множество стимулов NLR, а также избыточная экспрессия ASC [12, 13] приводят к образованию очагов, которые, как правило, рассматриваются как активные формы инфламмасом [13-15]. Будучи установленным на биологическом уровне, функциональный механизм ASC-опосредованного образования очагов и особенно роль его адаптерных доменов в этом процессе остаются загадочными. Обычно считается, что образование очагов ASC опосредуется его доменом PYD, поскольку мутации в этом домене приводят к подавлению аутоолигомеризации ASC [16].Предлагаемая роль CARD до сих пор ограничивалась простым набором Caspase-1 CARD, а функция, выходящая за рамки этого, такая как участие в олигомеризации ASC, ранее не предлагалась.

Еще один уровень сложности CARD-опосредованной передачи сигналов воспаления ASC происходит из исследований с участием NLRC4, ключевого медиатора врожденного иммунного ответа на инфекцию Salmonella typhimurium . Как CARD-содержащий NLR, белок NLRC4 в принципе способен напрямую взаимодействовать с CARD каспазы-1, исключая необходимость в адапторном белке [17].Тем не менее, усиливающая функция для ASC была предложена в контексте ответов на инфекцию Salmonella [15, 18], что дополнительно указывает на необходимость понимания CARD-зависимого сигнального механизма ASC.

Чтобы получить представление о роли системы CARD в ASC-опосредованном врожденном иммунитете, мы адаптировали анализ бимолекулярной флуоресцентной комплементации (BiFC) [19], что позволяет нам исследовать и визуализировать образование продуктивных очагов ASC () в живых клетках. Вкратце, технология BiFC использует комплементарные фрагменты Венеры, которая представляет собой улучшенный желтый флуоресцентный белок.Эти фрагменты не восстанавливаются спонтанно, но при слиянии с взаимодействующими белками расщепленные фрагменты связываются и восстанавливают функциональный флуоресцентный сигнал. Используя этот анализ, мы смогли различить нефункциональные сборки, которые показывают комплементацию флуоресцентного сигнала, но отсутствие образования платформы, и функциональные сборки, представляющие интактные инфламмасомоподобные очаги. В этом исследовании мы показываем, что PYD-домен ASC недостаточен для формирования очагов ASC, но также требует присутствия CARD.Неожиданно оказалось, что при экспрессии в комбинации с Caspase-1 CARD, CARD ASC достаточно для поддержки сборки продуктивных очагов. Кроме того, мы идентифицировали поверхностные остатки на CARD ASC и каспазы-1, мутации которых препятствовали образованию инфламмасом ASC. Затем мы протестировали влияние мутантов ASC на образование инфламмасом в мышиных макрофагальных клетках RAW264.7, чтобы определить важность CARD-зависимой олигомеризации в сигнальных путях NLRP3 и AIM2, а также в ответе NLRC4 на инфекцию Salmonella .

Образование олигомерных очагов, визуализированное системой BiFC

A. Схема анализа BiFC. Отсутствие взаимодействия между белками, несущими комплементарные фрагменты (VC, VN) Venus-GFP, приводит к отсутствию флуоресценции. Диффузная флуоресценция указывает на близость партнеров по связыванию из-за связывания или свободных сборок. Образование очагов указывает на определенную продуктивную олигомеризацию и, следовательно, образование сигнальной платформы. Б-Д. Результаты анализа BiFC, иллюстрирующие различные результаты в соответствии с приведенными выше схемами.Клетки HEK293T временно трансфицировали слияниями VN и VC. Клетки визуализировали на предмет флуоресценции через 24 часа после трансфекции. B. Пример отсутствия взаимодействия с использованием VC ASC-CARD и VN-Caspase-4 CARD. C. Диффузная флуоресценция наблюдалась после котрансфекции VN-ASC PYD и VC-ASC PYD. D. Образование очагов наблюдается после котрансфекции полноразмерного VN-ASC и полноразмерного VC-ASC. E. Изображения флуоресцентной микроскопии, показывающие BiFC карты VN-ASC CARD и VC-ASC CARD, приводящие к диффузной картине флуоресценции. F. Изображения флуоресцентной микроскопии, показывающие BiFC VC-ASC CARD и VN-Caspase-1 CARD, приводящие к образованию очагов. G. Клетки HeLa трансфицировали VN-Caspase-1 CARD и VC-ASC CARD. Изображения флуоресцентной микроскопии, показывающие перинуклеарную локализацию фокусов ASC CARD / Caspase-1 CARD с ядрами, визуализированными с помощью окрашивания DAPI. Для каждого эксперимента BiFC, описанного здесь и ниже, все конструкции VCASC были протестированы на автоактивацию путем совместной экспрессии с пустым вектором VN и конструкции VNCaspase-1 путем совместной экспрессии с пустыми векторами VC, соответственно.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Модели

Модель CARD Caspase-1 была создана с помощью MODELLER [20] на основе структуры Iceberg CARD от PDB 1DGN. Рисунки для модели Caspase-1 CARD и для ASC CARD (на основе структуры ASC из PDB 2KN6) были подготовлены с использованием Pymol (www.pymol.org).

Конструирование плазмид и мутагенез

CARD человеческой каспазы-1 и -4 были слиты с N-концевыми фрагментами Венеры вектора pVNN. CARD ASC и NLRC4 человека были слиты с C-концевыми фрагментами Венеры вектора pVCC.Векторы pVNN и pVCC были предоставлены лабораторией доктора Гордона Миллса (онкологический центр MD Anderson). Точечные мутации в Caspase-1 и ASC CARD были созданы с использованием сайт-направленного мутагенеза QuikChange (Stratagene). Все мутанты были проверены анализом секвенирования ДНК.

Анализ BiFC

Клетки эмбриональной почки человека (HEK) 293T или HeLa трансфицировали конструкциями слияния VN и VC с использованием липофектамина 2000 в соответствии с протоколом производителя. Клетки инкубировали при 37 ° C в течение 20 часов. Формирование флуорофора в живых клетках отображали с помощью флуоресцентной микроскопии.Изображения были получены с помощью цифрового инвертированного флуоресцентного микроскопа AMG EVOS. Для окрашивания ДНК клетки фиксировали 4% формальдегидом, трижды промывали 1xPBS, повышали проницаемость 0,1% Triton X-100 и метили DAPI.

Культура клеток и стабильные клеточные линии

Клетки эмбриональной почки человека (HEK) 293T, HeLa и RAW264.7 культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (GIBCO), с добавлением глутамина, антибиотиков и 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS) . Стабильный ASC дикого типа (WT) и мутантный ASC RAW264. 7 клеток были получены с использованием лентивирусной инфекции. Полноразмерный WT ASC и мутантный ASC субклонировали в экспрессионную плазмиду pLEX. Лентивирус продуцировали совместной экспрессией pLEX с упаковывающими плазмидами pM2.G и psPAX2 в 10-сантиметровых чашках клеток (HEK) 293T. Осветленные культуральные супернатанты использовали для заражения 10 ⁶ клеток RAW264.7 в 6-луночных планшетах в течение 24 часов при 37 ° C с последующим отбором пуромицина.

Иммуноблоттинг

Обработанный IL-1β, высвобожденный в супернатант культуры, был обнаружен иммуноблоттингом.Супернатанты собирали и образцы концентрировали осаждением хлороформ-метанол. Осадок осажденного белка ресуспендировали в буфере для образцов Лэммли и разделяли с помощью SDS-PAGE. Иммуноблоты зондировали поликлональными антителами против мышиного IL-1β (R&D Systems, AF-401-NA) при разведении 1: 1000. Клеточные лизаты зондировали моноклональным антителом против ß-актина (Sigma-Aldrich, A5441) при разведении 1: 1000 в качестве контроля загрузки. Для обнаружения сборок более низкого порядка лизаты из экспериментов по трансфекции разделяли с помощью нативного PAGE (4-16%) с использованием гелевой системы NativePAGE Novex Bis-Tris от Invitrogen.Присутствие сборок ASC CARD и Caspase-1 CARD было выявлено с помощью поликлональных антител против ASC (Calbiochem, ST1121) и поликлональных анти-GFP, которые избирательно распознают N-концевой фрагмент Венеры (Santa Cruz Biotechnology, sc-8334). при разведении 1: 1000.

Инфекция Salmonella typhimurium

Серовар дикого типа Enteritidis LK5 использовали для экспериментов по заражению (подарок С. Малоя, Государственный университет Сан-Диего, Сан-Диего, Калифорния). Перед инфицированием штаммы серовара Enteritidis выращивали в течение ночи в бульоне LB с высоким содержанием соли (бульон LB плюс 300 мМ NaCl), а затем субкультивировали в соотношении 1: 4 и позволяли расти еще в течение 2-3 часов.Бактерии дважды промывали фосфатно-солевым буфером и затем ресуспендировали в питательной среде OptiMem. Клетки RAW промывали фосфатно-солевым буфером и затем покрывали бактериальной суспензией так, чтобы множественность инфекции составляла 2, 20 или 200 бактерий на клетку млекопитающего. Супернатанты собирали через 2 часа для измерения секреции IL-1β с помощью ELISA. Секретируемый IL-1β измеряли с использованием мышиного IL-1β Ready-SET-Go! Наборы ELISA от eBioscience (Сан-Диего, Калифорния).

РЕЗУЛЬТАТЫ

CARD ASC критически важна для образования инфламмасом ASC

Способность ASC собираться в так называемые «фокусы» является ключевой для активации инфламмасом.Из-за его широко известной нерастворимости при сверхэкспрессии в бактериальных системах использование рекомбинантного ASC или его доменов для мониторинга образования олигомера in vitro ограничено. Поэтому мы адаптировали анализ бимолекулярной флуоресценции (BiFC) для качественного исследования механизма образования очагов ASC в живых клетках. Анализ BiFC основан на двух расщепленных фрагментах флуоресцентного белка Венеры. Фрагменты, обозначенные как VN и VC (концевой фрагмент Венеры -N и -C, соответственно), сливаются с белками, которые представляют собой потенциальных партнеров по связыванию.При взаимодействии между связывающими партнерами флуоресцентные фрагменты оказываются в непосредственной близости, восстанавливая функциональный флуоресцентный сигнал (), что приводит к тому, что мы называем «диффузным» сигналом флуоресценции (). Однако, если белки не только вступают во взаимодействие, но и образуют продуктивные сигнальные платформы, этот диффузный сигнал конденсируется в интенсивные пятнистые фокусы (сравните рис. Панели C и D), представляя собой четкую информацию для наблюдения и проверки этого события. Следовательно, эта система подходит для исследования образования очагов ASC, которое, как ранее наблюдалось, приводило к сфокусированным флуоресцентным платформам, когда ASC сливали с полноразмерным GFP [21].Кроме того, этот анализ имеет то преимущество, что не только отслеживает формирование очагов полноразмерных ASC, но также визуализирует формирование продуктивной платформы в свете конкретных доменов и их комбинаций. Когда технология BiFC была применена к полноразмерным VNASC и VC-ASC, мы действительно наблюдали образование очагов (), что сделало этот подход привлекательным инструментом для исследования системы CARD и ее влияния на воспалительные реакции, опосредованные ASC.

Затем мы исследовали роль каждого домена двухраздельного адаптера ASC в процессе образования инфламмасом.Обычно только PYD домен ASC рассматривается как движущая сила для образования инфламмасом ASC [13], тогда как роль ASC CARD, как полагают, ограничивается рекрутированием и связыванием Caspase-1 посредством гомотипических взаимодействий CARD-CARD. Однако, когда мы исследовали это в системе BiFC, мы обнаружили, что комбинация VN- и VC-ASC PYD приводила к диффузному флуоресцентному сигналу (). Этот результат был неожиданным, поскольку он указывает на то, что домены PYD проявляют сродство друг к другу, но не могут образовывать минимальные платформы ASC.Точно так же VN- и VC-ASC CARD показали диффузную флуоресценцию, что указывает на привлекательность CARD-CARD (). Наблюдаемое образование очагов в контексте полноразмерных ASC и отсутствие очагов, когда любой домен экспрессировался отдельно, указывает на необходимость обоих доменов и, таким образом, на активную роль CARD в управлении ASC-зависимым образованием инфламмасом.

Учитывая важность ASC CARD в сборке инфламмасом, мы дополнительно исследовали взаимосвязь с его нижележащей мишенью Caspase-1 CARD, особенно в отношении образования очагов.Неожиданно совместная экспрессия VC-ASC CARD с VN-Caspase-1 CARD привела к образованию платформы (). Полученные фокусы были подобны фокусам, сформированным в анализе BiFC с использованием полноразмерного ASC. Более того, эти очаги ASC-CARD / Caspase-1-CARD также обнаруживают те же атрибуты, а именно наличие одного отчетливого перинуклеарного очага на клетку (), что ранее наблюдалось для эндогенных инфламмасом ASC [12]. Образование фокусов исключительно за счет CARD этих двух белков указывает на активную роль Caspase-1 CARD в формировании продуктивной платформы.

Платформы ASC и Caspase-1 CARD являются высокоолигомерными и включают несколько поверхностей на ASC и две основные области на Caspase-1 CARD

Наблюдаемые фокусы, образованные картами ASC / Caspase-1 в нашем анализе BiFC, позволили нам исследовать поверхности как на КАРТАХ ASC и Caspase-1 в отношении сборки платформы. Используя структуру ASC CARD [22] и модель Caspase-1 CARD, основанную на структуре ЯМР Айсберга [23] (дополняют рисунки 1A и 1B), мы мутировали несколько заряженных, экспонированных растворителю остатков, покрывающих все поверхности на обоих доменах.В первой серии экспериментов мы тестировали мутанты Caspase-1 CARD с помощью анализа BiFC и временно экспрессировали WT и мутант VNCaspase-1 CARD вместе с WT VC-ASC CARD, чтобы исследовать их способность формировать функциональные платформы. Подмножество мутантов (R10E, D27R, E41R, K42E, R55E и D59R) Caspase-1 CARD не только устраняло образование очагов, но также приводило к потере флуоресценции, что указывает на прекращение взаимодействия (). Эта потеря не является следствием снижения уровней экспрессии мутантов из-за неправильной укладки или других факторов, как показано на.Эти эксперименты представляют собой широкое продолжение предыдущего исследования, в котором сообщалось, что мутация D27G Caspase-1 CARD прерывает передачу сигналов ASC / Caspase-1 CARD [24]. Кроме того, мы показываем, что все мутанты, приводящие к потере образования очагов и взаимодействия, находятся на двух основных поверхностях (). Первая ключевая поверхность образована спиралями 1, 3 и 4 (R10, K42, R55, D59), в то время как вторая область, необходимая для образования фокусов, расположена в спиралях 2 и 3 (D27, K42) карты Caspase-1 CARD. Мутация остатков E8R, R15E на спирали 1, R33E в петле, соединяющей спирали 2 и 3, R45D в спирали 3 и Q67R, Y75E и E78R на спирали 5, не оказала влияния на формирование очагов (и дополняет рисунок 1C).

Мутационный анализ поверхностей Caspase-1 CARD в отношении образования очагов с помощью WT ASC CARD

A. Результаты BiFC для клеток HEK293T, трансфицированных WT или мутантной VN-Caspase-1 CARD вместе с WT VC-ASC CARD. Для различных мутантов каспазы-1 наблюдалось либо отсутствие флуоресценции, либо образование очагов. Мутанты R10E, D27R, E41R, K42E, R55E и D59R приводят к потере связывания, тогда как мутанты R15E и R45D не проявляют влияния на образование очагов (F = Foci, N = нет взаимодействия). B. Клеточные лизаты подвергали иммуноблоттингу для VN-GFP (изображающего Caspase-1 CARD) и ß-актина в качестве контроля загрузки, демонстрируя аналогичные уровни экспрессии мутантных конструкций Caspase-1 по сравнению с WT Caspase-1.

Затем, VC-ASC CARD WT или мутанты котрансфицировали WT VN-Caspase-1 CARD. Мутанты, покрывающие несколько поверхностей (R125D, E130R, D134R, Y137E, E144R, R160E и D191R), утратили способность образовывать очаги, тогда как мутанты D143A, Q145A, Y146E и R150E не проявили никакого эффекта (). Опять же, как и в случае с Caspase-1 CARD, все мутанты ASC CARD показывают аналогичную или большую экспрессию по сравнению с CARD дикого типа ().Это указывает на участие множества поверхностей как на ASC, так и на каспазе-1 (дополните Рисунки 1A и B). Однако в случае мутантов ASC диффузная флуоресценция все еще наблюдалась, что указывает на ассоциации низкого порядка, но неспособность размножить образование продуктивной платформы.

Мутационный анализ поверхностей ASC CARD в отношении образования очагов с WT Caspase-1 CARD

A. HEK293T клетки временно трансфицировали VN-Caspase-1 CARD и VC-ASC CARD мутантами WT или ASC CARD, соответственно.Через 24 часа после трансфекции образование очагов анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Показаны репрезентативные изображения с флуоресцентной микроскопии. Мутанты ASC R125D, E130R, D134R, Y137E, E144R, R160E и D191R приводят к диффузному фенотипу, тогда как мутанты D134A, Y146E, Q145A и R150E приводят к образованию очагов (F = очаги, D = диффузное окрашивание). B. Иммуноокрашивание полных клеточных лизатов, показывающее правильную экспрессию слитых белков. Лизаты клеток исследовали на наличие ASC и β-актина в качестве контроля загрузки. C. Клетки, трансфицированные WT или мутантами (E130R, D134R, E144R, Q145A, Y137E) VC-ASC CARD и WT VN-Caspase-1 CARD, анализировали в анализе BiFC через 24 ч после трансфекции и затем лизировали добавлением Native Буфер для лизиса PAGE (Invitrogen) и обработка ультразвуком. Общие лизаты наносили на Native PAGE и проводили иммуноблоттинг для ASC и VN-GFP (изображающих Caspase-1 CARD). Только мутанты, вызывающие «диффузный» фенотип, показали присутствие сборок ASC-Caspase-1 CARD низкого порядка, которые были способны проникать в гель-матрицу.Выше показаны высокоолигомерные ансамбли с очень низкой подвижностью. Клеточные лизаты также исследовали на бета-актин в качестве контроля загрузки (внизу).

Для дальнейшего изучения природы сборок, демонстрирующих диффузную флуоресценцию, мы лизировали клетки, трансфицированные конструкциями VC-ASC (WT и мутанты) и VN-Caspase-1, и подвергали их нативному PAGE. Для этого клетки ресуспендировали в буфере для лизиса и обрабатывали ультразвуком. Примечательно, что для нативного PAGE использовали лизаты целых клеток, поскольку центрифугирование приводит к преципитации интактных очагов ASC (данные не показаны).Иммуноблоттинг для конструкций ASC и Caspase-1 показал, что только клетки, содержащие «диффузные» мутанты ASC, показали наличие низкоолигомерных сборок, мигрирующих в нативный PAGE, тогда как клетки, содержащие функциональные фокусы WT ASC-CARD и Caspase-1 CARD, полностью лишены этих низко-олигомерных сборок. олигомерные расположения (). Таким образом, низкоолигомерные сборки, сохраняющие растворимость, вероятно, не представляют собой активные сигнальные платформы.

CARD-зависимые очаги ASC коррелируют с опосредованным каспазой-1 процессингом IL-1β ниже как NLRP3, так и AIM2

Для проверки наших результатов анализа BiFC и дальнейшего исследования важности CARD-опосредованной олигомеризации в активации инфламмасом мы протестировали мутанты WT и ASC на их способность опосредовать передачу сигналов NLRP3 и AIM2 в более физиологических условиях. Мы выбрали линию клеток макрофага RAW264.7, в которой отсутствует эндогенный ASC, и создали стабильные клеточные линии, восстановленные либо с использованием полноразмерных мутантов WT ASC, либо ASC. Стабильные клеточные линии заражали с использованием дивергентных стимулов, которые, как было показано, запускают образование инфламмасомы NLRP3, состоящего из (i) АТФ, опасного сигнала, который запускает высвобождение калия и мобилизацию Ca ²⁺ [25]; (ii) пептидогликан (PGN), известный патоген-ассоциированный молекулярный образец (PAMP), происходящий из стенок бактериальных клеток [26]; и (iii) мононатрия урат (MSU), имитирующий эффект кристаллов мочевины при подагре [27].Как и ожидалось, клетки RAW264.7, экспрессирующие WT ASC, приводили к активации инфламмасом и последующему высвобождению обработанного IL-1β после обработки LPS и ATP (). Добавление zVAD-fmk предотвращало процессинг IL-1β, показывая зависимость этого процесса от каспазы. Напротив, RAW-клетки, экспрессирующие мутанты ASC E130R, D134R или E144R, которые привели к диффузному фенотипу без образования продуктивных очагов, продуцировали уровни IL-1β, аналогичные отрицательному контролю (RAW-клетки без ASC) после обработки всеми стимулами NLRP3 ( ).Этот дефект не был результатом разницы в синтезе про-ИЛ-1β, поскольку иммуноблоттинг показал эквивалентные уровни про-ИЛ-1β во всех клеточных линиях (). Эти находки подтверждают решающую роль ASC CARD для передачи сигналов воспаления NLRP3-ASC и активации каспазы-1 в клеточном контексте.

«Диффузные» мутанты ASC не могут индуцировать ответ IL-1ß на стимуляцию инфламмасом NLRP3 и AIM2

A. Клетки RAW264.7, стабильно экспрессирующие WT ASC, мутантный ASC (E130R, D134R, E144R) или пустой вектор были праймированы для продуцирование про-ИЛ-1β с использованием 1 мкг / мл ЛПС в течение четырех часов с последующей стимуляцией 5 мМ АТФ в присутствии и в отсутствие zVAD в течение 30 минут.Супернатанты анализировали на продукцию IL-1β, указывающую на зависимую от инфламмасомы активацию каспазы-1, с использованием ELISA и иммуноблоттинга. Эквивалентные уровни экспрессии ASC WT и мутантов, а также контроль ß-актина в лизатах анализировали с помощью иммуноблоттинга. Супернатант SN, экстракт клеток CX. B. Аналогично A, клетки RAW264.7, стабильно экспрессирующие WT ASC, мутантный ASC или пустой вектор, стимулировали агонистами NLRP3 MSU (100 мкг / мл) и PGN (5 мкг / мл) после обработки LPS в 96-луночном формате. .Супернатант собирали через четыре часа после стимуляции и анализировали на секрецию IL-1β с помощью ELISA (среднее ± стандартное отклонение; n = 3). C. Эквивалент A, B, за исключением стимула AIM2 poly (dA: dT) (1 мкг / мл), который применяли после прайминга LPS.

Для дальнейшего расширения нашего исследования мы включили PAMP-чувствительный фактор AIM2, который также формирует ASC-зависимые каспазу-1, активирующую инфламмасомы. AIM2 содержит N-концевой домен PYD, но в отличие от белков NLR имеет C-концевой домен HIN200, который воспринимает двухцепочечную ДНК в ответ на бактериальную или вирусную инфекцию [28-30].Наиболее важно, что в AIM2 отсутствует домен NACHT, типичный для NLRs, который, как полагают, формирует кольцевые структуры типа AAA + и, как сообщается, служит в качестве единицы олигомеризации [31], которая управляет образованием инфламмасом. Таким образом, инфламмасомы AIM2 представляют собой привлекательный инструмент для дальнейшего исследования роли CARD-зависимой олигомеризации ASC в этом воспалительном сигнальном пути.

Таким образом, мы протестировали влияние мутантов ASC CARD на передачу сигналов AIM2 с использованием поли-dAdT, аналога дцДНК и специфического активатора AIM2.Наши результаты показывают, что мутанты ASC, которые привели к диффузному фенотипу в системе BiFC, также продемонстрировали значительное снижение продукции IL-1β при активации AIM2, в то время как WT ASC продемонстрировали устойчивую секрецию IL-1β (). Таким образом, подобно NACHT-содержащим NLR, для передачи сигналов AIM2 требуется функциональная карта ASC CARD, что указывает на важную роль карты в управлении процессом передачи сигналов.

Решающая роль ASC CARD в NLRC4-опосредованной инфекции

Salmonella typhimurium

Далее мы использовали полученные данные о роли ASC CARD в процессе олигомеризации для дальнейшего исследования неуловимой функции ASC в Salmonella -индуцированной активация цитокинов, опосредованная NLCR4.В отличие от белков NLRP, NLRC4 содержит N-концевой CARD, который в принципе позволяет прямое взаимодействие с CARD-содержащими мишенями, исключая необходимость в адаптере ASC, содержащем PYD / CARD. NLRC4 является известным сенсором флагеллина во время инфекций Salmonella typhimurium и Legionella и опосредует активацию каспазы-1, приводящую к процессингу IL-1β [32, 33]. N-концевой CARD NLRC4, как было показано, напрямую взаимодействует с CARD каспазы-1 [17]. Напротив, недавнее исследование описало формирование NLRC4-зависимых очагов, которые включают ASC и Caspase-1, при заражении Salmonella [15].Однако не было описано никаких доказательств прямого взаимодействия между NLRC4 и ASC, и точная роль ASC в комплексе инфламмасом NLRC4 до сих пор полностью не изучена.

Поэтому мы проверили влияние ASC на взаимодействие VN-NLRC4 CARD и VC-Caspase-1 CARD. С этой целью мы экспрессировали CARD VN-NLRC4 и VC-Caspase-1 в присутствии или в отсутствие полноразмерных ASC. В самом деле, совместная экспрессия полноразмерных myc-tagged ASC вместе с VN-NLRC4 CARD и VC-Caspase-1 CARD вызвала переход от диффузного окрашивания к пунктированию флуоресцентных фокусов ().Затем мы протестировали мутанты ASC E130R и D134R, которые являются мутантами CARD, которые, как мы обнаружили, вызывают диффузные паттерны флуоресценции в предыдущих разделах, поэтому у них отсутствует способность к размножению образования продуктивной платформы. В самом деле, при использовании для замены WT ASC в экспериментах по коэкспрессии с VN- / VC-tagged CARDs NLRC4 и Caspase-1, фокусы, описанные выше, были потеряны и наблюдалась диффузная картина (). Взятые вместе, эти находки показывают и визуализируют, что платформа ASC является критической для образования продуктивных очагов воспаления NLRC4, и подтверждают идею, что эффективный процессинг IL-1β зависит от ASC. Чтобы проверить и расширить функцию ASC в отношении передачи сигналов воспаления NLRC4, мы инфицировали клетки RAW264.7, стабильно экспрессирующие мутанты WT или ASC (E130R, D134R), с помощью Salmonella typhimurium . В соответствии с образованием очагов, наблюдаемым в анализе BiFC, WT ASC приводил к устойчивому высвобождению IL-1β при заражении Salmonella (). В соответствии с тем фактом, что формирование платформы ASC требуется для эффективной активации каспазы-1 и, таким образом, расщепления про-IL-1β, клетки RAW, экспрессирующие мутанты ASC E130R и D134R, показали примерно десятикратное снижение ответа на инфекцию Salmonella , аналогично ответу, наблюдаемому для пустого векторного управления ().Это снижение не было результатом разницы в синтезе про-ИЛ-1β, поскольку иммуноблоттинг выявил эквивалентные уровни про-ИЛ-1β во всех клеточных линиях (). Кроме того, потребность в ASC для NLRC4-опосредованной секреции IL-1β наблюдалась для различных множественностей инфекции (рис. 2 в дополнении). Таким образом, в соответствии с результатами анализа BiFC, эксперименты по заражению также выявили ключевую роль ASC и его CARD в NLRC4-опосредованном ответе на инфекцию Salmonella .

ASC CARD требуется для образования очагов между NLRC4 CARD и Caspase-1 CARD и для активации воспаления NLRC4 при заражении Salmonella

A. Анализ моста BiFC. Клетки HEK293T трансфицировали VC-NLRC4 CARD и VNCaspase-1 CARD. Добавление полноразмерного WT ASC приводило к изменению диффузного окрашивания на точечное, тогда как полноразмерные мутанты ASC E130R и D134R были неспособны индуцировать образование очагов (слева). Иммуноокрашивание на ASC и ß-актин, показывающее надлежащие уровни экспрессии для WT ASC и мутантов (справа). B. Клетки RAW264.7, стабильно экспрессирующие WT ASC, мутантный ASC или пустой вектор, инфицировали Salmonella (MOI 20) в течение 3 часов.Супернатанты анализировали на продукцию IL-1ß с помощью ELISA (среднее ± стандартное отклонение; n = 3) и иммуноблоттинга с использованием антитела против IL-1ß. Лизаты клеток также анализировали с помощью иммуноблоттинга, показывая эквивалентные уровни экспрессии мутантов ASC WT и ASC. Лизаты клеток зондировали на бета-актин в качестве контроля загрузки.

ОБСУЖДЕНИЕ

В этом исследовании мы применяем комбинацию технологии анализа комплементации белков на основе флуоресценции и физиологических показателей, чтобы показать роль ASC CARD в ASC-опосредованных сигнальных путях инфламмасом.Мы показываем значительную роль ASC CARD в формировании очагов ASC и обнаруживаем, что PYD недостаточен для управления формированием платформы. Более того, мы показываем, что ASC CARD в отдельности способна образовывать фокусы в сочетании с CARD своей целевой Caspase-1. Это неожиданное участие в формировании очагов может указывать на общую роль Caspase-1 CARD или других белков семейства доменов смерти в увеличении сборки сигнальной платформы в «механизме обратной связи с мишенью». Кроме того, из-за своей способности формировать только очаги, CARD могут также напрямую взаимодействовать с другими факторами, управляющими образованием инфламмасом, такими как белки каркаса [14].Насколько нам известно, наш анализ NLRC4 / ASC / Caspase-1 BiFC является первой системой, визуализирующей прямое взаимодействие ASC с NLRC4 / Caspase-1, а также его абсолютную потребность в формировании очагов.

Используя анализ BiFC в качестве качественного инструмента для визуализации образования очагов, мы провели обширный мутационный скрининг, охватывающий поверхностные остатки как на картах ASC, так и на Caspase-1 CARD, и обнаружили, что в формировании ASC CARD-зависимых очагов участвуют несколько поверхностей, в то время как два основных поверхности требуются для КАРТЫ Caspase-1.Впоследствии мы воссоздали клеточную линию макрофагов, которая естественным образом лишена ASC, с полноразмерными мутантами ASC WT или CARD, и наблюдали, что отсутствие очагов образования мутантов ASC CARD в системе BiFC коррелировало с потерей секреции IL-1β. Эта корреляция наблюдалась как для NLRP3-, так и для AIM2-зависимой активации каспазы-1, подчеркивая критическую роль ASC CARD в формировании функциональных инфламмасом. Наконец, наша система позволила нам изобразить и визуализировать неуловимую функцию ASC в формировании инфламмасомы NLRC4 при заражении Salmonella .Используя CARD NLRC4, ASC и Caspase-1 в трехкомпонентном «мостиковом» анализе BiFC, мы показали, что ASC является ключом к образованию продуктивных очагов. При испытании в физиологическом контексте мутанты ASC, которые не могут размножать образование очагов в системе BiFC, приводят к десятикратному снижению секретируемого IL-1β при заражении Salmonella , аналогично клеткам, лишенным ASC. Эти данные раскрывают важную связующую функцию ASC в инфламмасоме NLRC4-Caspase-1, опосредованной Salmonella .

В совокупности наше исследование не только показывает новую ключевую роль CARD в формировании высокоолигомерных функциональных инфламмасом ASC, но также проливает новый свет на функцию ASC при NLRC4-зависимой инфекции Salmonella . Кроме того, он представляет собой модель для исследования сигнальных платформ, которые полагаются на продуктивную олигомеризацию для передачи сигнала. Мы прогнозируем, что используемый здесь подход может быть применим к исследованиям других больших мультимерных белковых комплексов, таких как бляшкообразующие расстройства, возникающие в результате аберрантных событий агрегации, как описано для болезни Альцгеймера, Хантингтона и Паркинсона.

(PDF) Угловой контроль пласта для круговых мобильных роботов

(a) Траектории робота

0246810

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

2

3

4

5

(б) Межцентровые расстояния

0 2 4 6 8 10

0

0,1

0,2

0,3

0,4

3 4 5 6 7 8 9 10

0

2

4

6

8

10 10-3

(c) Погрешности внутреннего угла

Рис.2. Моделирование с командой из 4-х круговых мобильных роботов с радиусом r = 1. На левой панели у нас есть траектории робота; Пунктирные кружки представляют

исходную конфигурацию, а сплошные кружки — окончательные положения робота. Сплошные линии — траектории центра робота. На центральной панели сходимость

расстояний dij (пунктир) к их желаемым значениям d?

ij (сплошной). Черная сплошная линия представляет dmin = 2 между роботами. Правая панель

показывает сходимость внутренних угловых ошибок.Сплошной черной линией показано значение b = 0,08 для гиперкуба Hb.

V. ЧИСЛЕННЫЙ ПРИМЕР

A. Установка для моделирования

Мы применяем предложенный закон управления к группе из 4-х круговых роботов

с радиусом r = 1. Общая цель состоит в том, чтобы сформировать прямоугольную угловую форму

с внутренней -центровые расстояния указаны как d?

12 =

д?

34 = 3, д?

13 = д?

24 = 4, а d?

14 = 5. Используя (5), получаем

cos θ?

12 = cos θ?

34 = 0.7778, cos θ?

13 = cos θ?

24 = 0,8750,

и cos θ?

14 = 0,9200. Начальная конфигурация, обозначенная пунктирными кружками

на рис. 2 (a), имеет центральные положения p1 (0) =

[0,0]>, p2 (0) = [2.05,0]>, p3 (0 ) = [−2,05,0,05]> и

p4 (0) = [−1,1,85]>. Используя эту начальную конфигурацию, мы

можем проиллюстрировать функцию предотвращения столкновений предложенного закона управления

и сходимость к желаемой форме формации

, даже если p (0) 6∈ Hb.Мы можем получить b = 0,08, а

установить коэффициент усиления K = 50 для ускорения сходимости.

B. Результаты моделирования

Траектории роботов изображены на рис. 2 (а).

Кроме того, межцентровые расстояния и внутренний угол

ошибок между роботами приведены на рис. 2 (б) и 2 (в),

соответственно. Давайте сосредоточимся на роботе 2, зеленом роботе в

Рис. 2 (a). У него есть соседние роботы 1 (красный робот) и

4 (красный робот). Из рисунка видно, что, поскольку

роботов 2 и 1 изначально находятся близко друг к другу, робот 2

быстро удаляется от робота 1 и почти достигает желаемого ограничения

с роботом 1. Однако из-за этого движения

его расстояние до соседнего робота 4 увеличилось примерно до

4.9. Это также можно наблюдать на рис. 2 (c), где мы видим

увеличение сигнала пурпурного цвета, представляющего ошибку

| e24 |. Поскольку робот 2 теперь достаточно далеко от робота 1, он затем пытается удовлетворить внутреннему угловому ограничению с помощью робота 4

, что можно наблюдать на обоих рисунках.2 (б) и 2 (в). Увеличив масштаб

на рис. 2 (c), мы можем наблюдать экспоненциальную сходимость

сигналов ошибки, начиная примерно с t = 3 с. Тогда все сигналы ошибки

будут значительно ниже порогового значения b = 0,08.

VI. ВЫВОДЫ

В этом письме мы решили задачу управления формированием

lem для круговых мобильных роботов, подчиненных ограничениям внутреннего угла

. Был предложен закон управления градиентным спуском, требующий только

измерений относительного пеленга для реализации.Этот закон управления имеет локальное экспоненциальное преобразование

для динамики ошибок и обеспечивает предотвращение столкновений

между соседними роботами.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

[1] К.-К. О, М.-К. Парк, Х.-С. Ан, «Исследование мультиагентного контроля пласта

», Автоматика, т. 53, pp. 424–440, mar 2015.

[2] З. Сан, С. Моу, Б.Д. Андерсон и М. Цао, «Экспоненциальная устойчивость

для систем управления пластом с обобщенными контроллерами: унифицированный подход

. , ”Системы и письма управления, т.93, стр. 50–57, июл 2016 г.

[3] С. Чжао и Д. Зелазо, «Жесткость подшипника и почти глобальная стабилизация пласта —

», IEEE Transactions on Automatic Con-

trol, vol. . 61, нет. 5, стр. 1255–1268, май 2016 г.

[4] ——, «Теория жесткости подшипников и ее приложения для управления и

оценка сетевых систем: жизнь за пределами жесткости на расстоянии», IEEE

Control Systems, vol. 39, нет. 2, pp. 66–83, Apr. 2019.

[5] L.Чен, М. Цао и К. Ли, «Угловая жесткость и ее использование для стабилизации плоских формаций

».

[6] К. Цао, З. Хань, X. Ли и Л. Се, «Жесткость отношения расстояний в распределенном управлении пластом

», в 15-й Международной конференции 2018 г.

по управлению, автоматизации и робототехнике. и видение (ICARCV). IEEE, ноябрь

2018.

[7] К. Цао, Д. Ли и Л. Се, «Теория жесткости отношения подшипников к расстоянию

с применением к непосредственно аналогичному контролю пласта», Automatica,

т.109, стр. 108540, ноябрь 2019 г.

[8] Ф. Мехдифар, К. П. Бечлиулис, Ф. Хашемзаде и М. Барадаранния,

«Предписанное дистанционное управление формированием систем с несколькими агентами

(расширенная версия)».

[9] Д. Франк, Д. Зелазо и Ф. Аллгвер, «Контроль пласта только с пеленгом

с ограниченным визуальным восприятием: дело с двумя агентами», IFAC-PapersOnLine,

vol. 51, нет. 23, pp. 28–33, 2018.

[10] Х.Г. де Марина, М. Цао и Б.Джаявардхана, «Управление жесткими формациями

мобильных агентов при несовместимых измерениях», IEEE

Transactions on Robotics, vol. 31, нет. 1, pp. 31–39, feb 2015.

[11] Ф. Булло, Лекции по сетевым системам, 1-е изд. Kindle Direct

Publishing, 2019, при участии Дж. Кортеса, Ф. Дорлера и С.

Мартинеса. [В сети]. Доступно: http://motion.me.ucsb.edu/book-lns

[12] BDO Anderson, C. Yu, B. Fidan, and JM Hendrickx, «Архитектура управления жестким графом

для автономных образований», IEEE Control

Системный журнал, т.28, вып. 6, pp. 48–63, Dec 2008.

[13] М. де Кейрос, X. Кай и М. Фемстер, Управление формированием систем агентов Multi-

. John Wiley & Sons, Ltd, январь 2019 г.

[14] З. Сан, С. Моу, М. Дегхат и Б.Д.О. Андерсон, «Распределение по конечному времени. -мерные ненаправленные жесткие образования », Международный журнал

робастного и нелинейного управления, т. 26, вып. 13, стр.2824–2844, ноя

2015.

[15] Х. К. Халил, Нелинейные системы (3-е издание). Pearson, 2001.

Типы карт контроля доступа

В наши дни каждое коммерческое предприятие предпочитает использовать контроль доступа из-за безопасности, которую они предлагают. Когда дело доходит до крупных заведений, часто становится проблемой вручную управлять входящими в помещения, особенно если это более чем одна точка доступа. Использование нескольких человек для управления точками доступа часто обходится дорого и менее безопасно, чем использование автоматизированных технологий. Контроль доступа Чикаго обычно предполагает предоставление уполномоченным лицам пропускных карт или ключей, которые они используют для входа в помещения.

Это почти то же самое, что получить доступ в гостиничный номер по пропускному ключу. Это делает процесс управления точками доступа в здании намного проще и удобнее. В наши дни даже малые предприятия и жилые районы используют контроль доступа для большей безопасности.

Существуют различные типы ключей доступа, которые предоставляются сотрудникам для доступа в здание.Некоторые из них более распространены, чем другие, а некоторые более безопасны. Здесь мы обсуждаем четыре основных карты контроля доступа, их полезность и особенности.

Традиционные ключевые карты

Если вы хоть немного знакомы с системами контроля доступа, то знаете, что такое традиционная ключ-карта. Это наиболее распространенный тип карты контроля доступа, который работает, помещая карту в считывающее устройство, чтобы получить доступ в здание.

Бесконтактные карты

Они очень похожи на традиционные карточки-ключи, но вместо того, чтобы проводить их по считывателю, вы должны положить их рядом со сканером.Карты близости отлично подходят для предоставления базового доступа в коммерческие помещения.

Активные проксимити карты

Активные бесконтактные карты немного отличаются от других ключевых карт, потому что они имеют внутреннюю литиевую батарею для питания.

Преимуществом этого типа карты является то, что она может быть размещена подальше от сканера и при этом работать. Однако эти карты обычно служат пять лет или меньше, а также стоят дороже из-за разрядки аккумулятора.

Бесконтактные проксимити карты

Это очень универсальные и недорогие карточки-ключи, используемые для базового доступа, данных о посещаемости и биометрических шаблонов. Хотя в них не так много места для хранения большого количества данных, они доступны по цене и являются полезным решением для базовых нужд.

Контроль доступа Чикаго — это потребность часа. Свяжитесь с CES Complete, чтобы ваше коммерческое предприятие было оборудовано передовыми системами контроля доступа для повышения безопасности и удобства.

Контроль образования пузырьков на электродах | MIT News

Использование электричества для разделения воды на водород и кислород может быть эффективным способом производства экологически чистого водородного топлива с дополнительными преимуществами, если это электричество вырабатывается из возобновляемых источников энергии. Но по мере совершенствования технологий разделения воды, часто с использованием пористых электродных материалов для обеспечения большей площади поверхности для электрохимических реакций, их эффективность часто ограничивается образованием пузырьков, которые могут блокировать или забивать реактивные поверхности.

В исследовании Массачусетского технологического института впервые было проанализировано и количественно определено, как пузырьки образуются на этих пористых электродах. Исследователи обнаружили, что существует три различных способа образования пузырьков на поверхности и отхода от поверхности, и что ими можно точно управлять, регулируя состав и обработку поверхности электродов.

Полученные данные могут быть применимы и к множеству других электрохимических реакций, включая те, которые используются для преобразования углекислого газа, улавливаемого из выбросов электростанций или воздуха, в топливо или химическое сырье.Работа описана сегодня в журнале Joule , в статье приглашенного ученого из Массачусетского технологического института Рюичи Ивата, аспиранта Ленан Чжан, профессоров Эвелин Ван и Бетара Галланта и трех других.

«Разделение воды — это, по сути, способ получения водорода из электроэнергии, и его можно использовать для смягчения колебаний подачи энергии из возобновляемых источников», — говорит Ивата, ведущий автор статьи. Это приложение побудило команду изучить ограничения этого процесса и способы их контроля.

Поскольку в результате реакции постоянно образуется газ в жидкой среде, газ образует пузырьки, которые могут временно блокировать активную поверхность электрода. «Контроль над пузырями — ключ к достижению высокой производительности системы», — говорит Ивата. Но мало изучены виды пористых электродов, которые все чаще изучаются для использования в таких системах.

Команда определила три различных способа образования пузырей и их выхода с поверхности. В одном случае, получившем название внутреннего роста и ухода, пузырьки крошечные по сравнению с размером пор в электроде.В этом случае пузырьки свободно улетают, а поверхность остается относительно чистой, способствуя процессу реакции.

В другом режиме пузырьки больше, чем поры, поэтому они имеют тенденцию застревать и закупоривать отверстия, значительно сокращая реакцию. И в третьем, промежуточном режиме, называемом капилляром, пузырьки среднего размера и все еще частично заблокированы, но им удается просачиваться через капиллярное действие.

Команда обнаружила, что ключевой переменной в определении того, какой из этих режимов имеет место, является смачиваемость пористой поверхности.Это качество, которое определяет, равномерно ли вода распределяется по поверхности или капает в капли, можно регулировать, регулируя покрытие, нанесенное на поверхность. Команда использовала полимер под названием PTFE, и чем больше его распыляли на поверхность электрода, тем более гидрофобным он становился. Он также стал более устойчивым к засорению более крупными пузырьками.

Новые эксперименты показали, что смачиваемость поверхности сильно влияет на то, как пузырьки образуются и покидают поверхность.Слева пористая поверхность с более высокой смачиваемостью приводит к небольшим пузырькам, которые быстро уходят, а более низкая смачиваемость (справа) приводит к более крупным пузырькам, которые закупоривают поры материала и снижают эффективность.

Переход довольно резкий, говорит Чжан, поэтому даже небольшое изменение смачиваемости, вызванное небольшим изменением покрытия поверхности, может резко повлиять на производительность системы. Благодаря этому открытию, по его словам, «мы добавили новый проектный параметр, который представляет собой отношение диаметра вылета пузырька [размера, которого он достигает до отделения от поверхности] и размера пор.Это новый показатель эффективности пористого электрода ».

Размер пор можно контролировать с помощью способа изготовления пористых электродов, а смачиваемость можно точно контролировать с помощью добавленного покрытия. Таким образом, «манипулируя этими двумя эффектами, в будущем мы сможем точно контролировать эти параметры конструкции, чтобы гарантировать, что пористая среда работает в оптимальных условиях», — говорит Чжан. Это предоставит разработчикам материалов набор параметров, которые помогут при выборе химических соединений, методов производства и обработки поверхности или покрытий, чтобы обеспечить наилучшие характеристики для конкретного применения.

В то время как эксперименты группы были сосредоточены на процессе расщепления воды, результаты должны быть применимы практически к любой электрохимической реакции с выделением газа, говорит команда, включая реакции, используемые для электрохимического преобразования захваченного диоксида углерода, например, из выбросов электростанции.

Галлант, доцент кафедры машиностроения Массачусетского технологического института, говорит: «Что действительно интересно, так это то, что по мере того, как технология расщепления воды продолжает развиваться, сфера деятельности выходит за рамки разработки каталитических материалов и конструирования массового транспорта, вплоть до того момента, когда эта технология готов к масштабированию.«Хотя это еще не коммерциализация для массового рынка, — говорит она, — они добиваются этого. И теперь, когда мы действительно начинаем расширять пределы скорости выделения газа с помощью хороших катализаторов, мы больше не можем игнорировать пузырьки, которые образуются, что является хорошим знаком ».

В команду Массачусетского технологического института также входили Кайл Уилке, Шуай Гонг и Минфу Хэ. Работа была поддержана Toyota Central R&D Labs, Альянсом исследований и технологий Сингапура и Массачусетского технологического института (SMART), Совместным фондом науки и технологий США и Египта и Китайским фондом естественных наук.

Можете ли вы изменить структуру своего бизнеса после регистрации?

Многие начинающие предприниматели будут регистрироваться в качестве индивидуальных предпринимателей из-за его доступного характера и возможности, предлагаемой организацией, осуществлять полный контроль над бизнесом. Предприниматели нередко начинают регистрацию в качестве индивидуального предпринимателя (или любого другого юридического лица), а затем рассматривают возможность перехода на организацию, которая может лучше подходить для их растущего бизнеса.Так можно ли поменять объекты после первоначального включения? Короткий ответ — да, но это также стоит поговорить с вашим бухгалтером или юрисконсультом в первую очередь, чтобы получить дальнейшие советы и ответить на любые вопросы, которые могут у вас возникнуть относительно процесса. Как только вы сделали это приоритетом и решили, что готовы изменить структуру своего бизнеса, вот что вам следует иметь в виду, когда вы думаете о переходе на новую организацию.

1. Объективно взвесьте все «за» и «против» каждого субъекта.

Согласно IRS, пять наиболее распространенных бизнес-структур — это индивидуальные предприниматели, партнерства, корпорации, компании с ограниченной ответственностью (LLC) и S-корпорации. Давайте подробнее рассмотрим преимущества, которые каждое из них предлагает вашему бизнесу, с точки зрения налогов и надежности.

Индивидуальное предприятие

Это один из наиболее распространенных типов создания бизнеса из-за его доступного характера и преимуществ того, чтобы быть самим себе начальником. Если вы хотите осуществлять полный контроль над своим бизнесом и работать в сфере, связанной с небольшими рисками ответственности, регистрация индивидуального предприятия может быть именно тем, что нужно вашему стартапу.Однако имейте в виду, что это лицо не отделяет личные активы от профессиональных. Поскольку не существует помощи по налогам или ответственности, индивидуальное предприятие возлагает на владельца полную ответственность за все, что происходит с бизнесом.

Партнерство

Думаете начать бизнес с членом семьи или другом? Изучите возможность создания партнерства, в котором вы можете вместе делить прибыль и убытки. Здесь вы сможете принимать решения с явного согласия всех других вовлеченных партнеров, но будьте осторожны — это лицо возлагает на каждого партнера ответственность за решения, а также действия, предпринятые в рамках бизнеса.

Корпорация

Если у вас большие планы по расширению и (в конечном итоге) выходу на биржу с вашим бизнесом, корпорация может быть вашим лучшим выбором для формирования. Вы сможете разделить свои профессиональные и личные активы и создать структуру, которая позволит выпускать акции и принимать деньги от инвесторов.

LLC

Как и корпорации, LLC также разделяют личные и профессиональные активы на случай непредвиденных обстоятельств.В качестве LLC вы также получите основные налоговые преимущества, в том числе экономию на налогах и выбор собственной налоговой организации — в качестве корпорации S или корпорации C.

Если у вас большие планы по расширению и (в конечном итоге) выходу на биржу с вашим бизнесом, корпорация может быть вашим лучшим выбором для формирования.

S Corporation

S корпорации передают чистую прибыль и убытки акционерам через «сквозную» структуру, которая облагается налогом на уровне акционеров только один раз, а не дважды.

2. Начать подачу статьи об изменении.

После того, как вы определили организацию, к которой хотите перейти, следующим шагом будет подача статьи о поправке. Также известные как сертификаты об изменениях, большинство штатов требует, чтобы любой зарегистрированный бизнес внес изменения в эти документы. Помимо смены юридических лиц, вы также можете подать поправку при изменении следующих сфер деятельности вашего бизнеса:

• Имена и адрес директоров или членов
• Адрес вашего офиса
• Имя и адрес зарегистрированного агента
• Номер объявленных акций
• Описание хозяйственной деятельности

Что делать, если вы являетесь ООО, которое хочет стать корпорацией исключительно в связи с корпоративными стратегическими изменениями, такими как налоговые соображения, выпуск акций или публичное размещение вашего бизнеса? В этом случае вы должны подать преобразование в штат вместо статьи о поправке.В большинстве штатов требуются документы о преобразовании, учредительные документы и сбор за регистрацию в качестве необходимых документов, сопровождающих регистрацию нового юридического лица.

3. Задокументируйте все изменения, внесенные в процессе преобразования.

Хотя эти изменения будут задокументированы государством посредством поправки, также важно, чтобы любые изменения или дополнения, внесенные в юридическое образование, были задокументированы в вашей корпоративной книге. Рассмотрим:

• Корректировка пунктов путем записи их в протокол в вашей корпоративной книге протоколов.
• Отслеживание изменений в вашей организации на годовом собрании и документирование любых изменений с резолюциями.
• Внесение заметок в ваш годовой отчет о любых изменениях, внесенных в состав владельцев, должностных лиц или директоров компании, а также о том, переезжала ли компания.

Независимо от того, преобразуете ли вы организации просто для стратегических изменений или вообще переходите на новые юридические образования, посоветуйтесь со своим юристом или юрисконсультом, прежде чем начинать, чтобы убедиться, что вы принимаете наилучшее возможное решение для своего бизнеса в долгосрочной перспективе.

Фото: Getty Images

Информация, содержащаяся в данном документе, предназначена только для общих информационных и образовательных целей и не является инвестиционной, финансовой, налоговой, юридической или иной профессиональной консультацией по любому вопросу. ЭТО НЕ ЗАМЕНА ПРОФЕССИОНАЛЬНЫХ ДЕЛОВЫХ СОВЕТОВ. Поэтому при необходимости обращайтесь за подобным советом в связи с любой конкретной ситуацией. Мнения и мнения третьих лиц, выраженные в данном документе, представляют собой мнение автора, докладчика или участника (в зависимости от обстоятельств) и не обязательно отражают взгляды, мнения и / или суждения компании American Express или любой из ее аффилированных и дочерних компаний. или подразделения.American Express не делает никаких заявлений и не несет ответственности за точность, своевременность, полноту или надежность любого такого мнения, совета или заявления, сделанного в данном документе.

Бесплатные карточки для создания букв алфавита

Не секрет, что есть ссылка на письмо и обучение чтению. Также не секрет, что дошкольники тяготеют к увлекательной учебной деятельности. Вот тут-то и появляется действий по формированию букв алфавита , как эти звуковые карты, начинающиеся с алфавита.Они не только для начертания или раскраски. Прочтите все три способа добавить эти рабочие листы для отслеживания писем в свой центр письма в дошкольном учреждении.

Формирование букв алфавита с использованием калькуляторов

Некоторые дошкольники рано и легко начинают учиться карандашу, плавно переходя через все этапы письма. Похоже, они умеют выучивать алфавит и правильно составлять буквы.

Для многих дошкольников это не так.Многим нелегко научиться писать буквы. Для некоторых дошкольников это дается нелегко или естественно. Они находят задачу написания писем утомительной и утомительной.

Так как изучение алфавита — такой большой шаг для дошкольников, то значит и научиться писать буквы. Они идут рука об руку. Исследования показывают, что существует прямая связь между обучением чтению и способностью составлять письма и писать. [источник]. Это означает, что любая высококачественная дошкольная программа будет обучать и позволять достаточно практиковаться как в распознавании букв, так и в звуках в соотношении с формированием букв.

Тем не менее, это утверждение подтверждается множеством исследований, как и мой собственный преподавательский опыт.

Один из моих сыновей плохо читал. Будучи более добрым учеником, он был умным и любопытным, и он любил школу. Он продвигался вперед, как и ожидал бы любой добрый учитель, благодаря учебной программе большой компании, без особых усилий изучая все буквы и звуки, а также все навыки фонематической осведомленности.

Но когда приближался конец его детского сада, он мог читать несколько слов cvc, не останавливаясь для декодирования, и он мог читать еще меньше слов с листа.Его чтение звучало так.

”I / k / / a / / n / / s / / i / / t / / o / / n / the / m / / a / / t /.”

Видите проблему здесь? Он не только пытался расшифровать часто встречающиеся слова, но, поскольку ему приходилось останавливаться и расшифровывать каждое слово в предложении, его понимание строго зависело от картинки в декодируемом.

Наблюдать за борьбой моего сына было нелегко, поэтому я вернулся к своим учебникам в колледже и поискал в Интернете самые свежие, наиболее авторитетные источники о том, как помочь борющимся читателям.И было кое-что, что я постоянно сталкивался в моем чтении … связь между чтением и письмом, которая для моего сына была недостающим компонентом в его инструкции по чтению.

Это положило начало созданию моих занятий по формированию букв алфавита, которые были найдены в моих дошкольных центрах грамотности. И это также заставило меня переоценить важность. письменной практики в дошкольном учреждении.

Формирование трех букв алфавита

Эти карточки для формирования букв можно использовать тремя различными способами, и уровень навыков вашего ученика будет определять, какой метод обучения вы выберете.

Формирование письма по отслеживанию пальца

Когда вы знакомите своего дошкольника с новой буквой алфавита, вы также вводите порядок формирования букв при написании этой буквы — даже если вы на самом деле не тренируетесь в написании буквы. Например, вы можете попросить вашего дошкольника написать письмо в воздухе, следуя вашему указанию, или вы можете попросить своего дошкольника нарисовать письмо наждачной бумагой.

Я выполняю оба этих действия, а затем следую за ним с помощью такой карточки для отслеживания букв, как эта, и предлагаю своему дошкольнику сначала попрактиковаться в отслеживании буквы пальцем.Вы можете добавить любое количество песнопений в процесс. Я предпочитаю использовать метод «Почерк без слез».

Большая линия вниз, лягушка прыгает вверх, большая линия вниз, маленькая линия.

Magic c, вверх, как вертолет, натыкайся назад и поворачивайся.

Трассировка пальца особенно хороша для малышей и младших дошкольников, которые все еще учатся основам формирования букв, но всем дошкольникам и учащимся детских садов, которые учатся писать, будут полезны упражнения по формированию букв алфавита, подобные этой.

Вам также могут понравиться эти упражнения по формированию букв алфавита для ваших центров

Просто нажмите на изображение ниже, чтобы узнать больше.

Сухое стирание начертания букв с последующим стиранием отпечатка пальца

Эти карточки для формирования начальных звуковых букв также можно положить в карман для сухого стирания, чтобы постоянно практиковаться. Дошкольники следуют инструкциям по формированию букв на карточке, возможно, произносят пение «Почерк без слез» (или другое аналогичное пение для формирования букв), когда пишут маркером для сухого стирания.Добавьте вторую практику, попросив вашего дошкольника стереть маркер пальцем, используя ту же буквенную форму.

Мои дошкольники говорят, что письмо повторяется каждый раз. По моему опыту, когда дошкольники начинают переход от начертания к копированию, песнопения помогают им напоминать, с чего начинать каждую букву на своем листе.

Начертание букв алфавита и раскраска мелками

Последний шаг — предложить вашему дошкольнику использовать цветные карандаши, чтобы раскрасить картинки на каждой карточке и обвести буквы.Эти карты для отслеживания алфавита также можно использовать для письма радугой, которое является распространенным и широко используемым упражнением по формированию букв, которое дает дошкольникам и ученикам детских садов еще больше практики в письме. Радужное письмо — это когда одна и та же буква повторяется несколько раз, используя цветные карандаши. Вы можете прочитать больше о радужном письме в этом посте. В нем подробно рассказывается о том, как научить дошкольников радужному письму.

Количество необходимых цветов будет зависеть от того, сколько раз вы хотите, чтобы ваш дошкольник упражнялся в письме.Обычно я выбираю от 3 до 6 раз. Трижды, если дошкольник отрабатывает несколько букв. Шесть раз, если они практикуют только несколько букв за раз.

Наконец, ваш дошкольник может раскрасить изображения на карточках для прослеживания формирования букв.

Сделайте упражнения по формированию букв алфавита еще интереснее

Когда я представляю своим дошкольникам новые буквы, я следую системе, описанной выше.

1. по отпечатку пальца
2. сухое стирание, затем отпечаток пальца
3. радужное письмо

Если у вас есть дошкольник, который не проявляет никакого интереса к обучению письму, или если у вас есть молодой дошкольник, попробуйте несколько из этих советов:

• Обведите букву самостоятельно маркером для сухого стирания и предложите малышу стереть ваши линии пальцем.
• Используйте дешевую вязаную варежку в качестве ластика для маркеров сухого стирания.
• Обводя букву, повторяйте название буквы снова и снова или повторяйте звук буквы снова и снова.