Дт 76 кт 91 означает: Дебет 76 Кредит 91 — что означает

Франческо Д’Аморе

¹ Институт неврологии и медицины, Исследовательский центр Юлих, Юлих, Германия

² Отделение нейрорадиологии, Больница Чирколо и Фонд Макки, Варезе, Италия

Фарида Гринберг

¹ Институт неврологии и медицины, Исследовательский центр Юлих, Германия

Йорг Маулер

¹ Институт неврологии и медицины, Исследовательский центр Юлих, Юлих, Германия

Норберт Галлдикс

³ Отделение неврологии, Медицинский факультет и университетская клиника Кельна, Кельнский университет, Кельн, Германия

⁴ Центр интегрированной онкологии (ИТ-директор), Университеты Аахена, Бонна, Кельна и Дюссельдорфа, Германия

Ганна Блаженец

¹ Институт неврологии и медицины, Исследовательский центр Юлих, Юлих, Германия

⁵ Отделение ядерной медицины, Медицинский центр— Фрайбургский университет, медицинский факультет Фрайбургского университета, Фрайбург, Германия

Ezequiel Farrher

¹ Институт неврологии и медицины, Исследовательский центр Юлих, Германия

Christian Filss

¹ Институт неврологии и неврологии Медицина, Исследовательский центр Юлих, Юлих, Германия

⁶ Отделение ядерной медицины, RWTH Aachen University, Ахен, Германия

Gabriele Stoffels

¹ Институт неврологии и медицины, Исследовательский центр Юлих, Юлих, Германия

Felix M Mottaghy

⁴ Центр интегрированной онкологии (CIO ), Университеты Аахена, Бонна, Кельна и Дюссельдорфа, Германия

⁶ Кафедра ядерной медицины, RWTH Ахенский университет, Ахен, Германия

⁷ Кафедра радиологии и ядерной медицины, Медицинский центр Маастрихтского университета (MUMC +), Маастрихт, Нидерланды

⁸ Отделение стереотаксии и функциональной нейрохирургии, Медицинский факультет и университетская клиника Кельна, Кельнский университет, Кельн, Германия

Филипп Ломанн

¹ Институт неврологии и медицины, Исследовательский центр Юлих, Юлих, Германия

⁸ Департамент стереотики xy и функциональной нейрохирургии, Медицинский факультет и Университетская клиника Кельна, Кельнский университет, Кельн, Германия

Надим Йон Шах

¹ Институт неврологии и медицины, Исследовательский центр Юлих, Юлих, Германия

⁹ Отделение Неврология, RWTH Ахенский университет, Ахен, Германия

¹⁰ JARA — BRAIN — Трансляционная медицина, Ахен, Германия

Карл-Йозеф Ланген

¹ Институт неврологии и медицины, Исследовательский центр Юлих, Юлих, Германия

⁴ Центр интегрированной онкологии (CIO), университеты Аахена, Бонна, Кельна и Дюссельдорфа, Германия

⁶ Отделение ядерной медицины, RWTH Ахенский университет, Ахен, Германия

¹ Институт неврологии и медицины, Исследовательский центр Юлих, Юлих, Германия

² Отделение нейрорадиологии, Circolo Ho spital and Macchi Foundation, Варезе, Италия

³ Отделение неврологии, Медицинский факультет и университетская клиника Кельна, Кельнский университет, Кельн, Германия

⁴ Центр комплексной онкологии (CIO), университеты Аахена, Бонн , Кельн и Дюссельдорф, Германия

⁵ Кафедра ядерной медицины, Медицинский центр Фрайбургского университета, Медицинский факультет Фрайбургского университета, Фрайбург, Германия

⁶ Кафедра ядерной медицины, RWTH Ахенского университета, Аахен, Германия

⁷ Отделение радиологии и ядерной медицины, Медицинский центр Маастрихтского университета (MUMC +), Маастрихт, Нидерланды

⁸ Отделение стереотаксии и функциональной нейрохирургии, Медицинский факультет и университетская клиника Кельна, Кельнский университет, Кельн , Германия

⁹ Отделение неврологии, RWTH Ахенский университет, Аахе n, Германия

¹⁰ JARA — BRAIN — Трансляционная медицина, Ахен, Германия

Эти авторы внесли равный вклад в работу.

Abstract

Предпосылки

Радиологическая дифференциация прогрессирования опухоли (TPR) от изменений, связанных с лечением (TRC) в предварительно обработанной глиобластоме имеет решающее значение. Это исследование было направлено на изучение диагностической ценности МРТ диффузного эксцесса в сочетании с информацией, полученной из O — (2- [ ¹⁸ F] -фторэтил) -1-тирозин ( ¹⁸ F-FET) ПЭТ для дифференциации TPR от TRC у пациентов с предварительно пролеченной глиобластомой.

Методы

Тридцать два пациента с гистомолекулярно определенной и предварительно пролеченной глиобластомой с подозрением на TPR были включены в это ретроспективное исследование.Двадцать один пациент был включен в группу TPR и 11 пациентов в группу TRC, согласно оценке невропатологии или клинико-радиологического наблюдения. Представляющие интерес трехмерные (3D) области были созданы на основе увеличенного поглощения ¹⁸ F-FET с использованием отношения опухоли к мозгу 1,6. Кроме того, карты эксцесса диффузии МРТ были получены из тех же областей интереса с использованием совместно зарегистрированных ¹⁸ изображений F-FET PET, а расширенный анализ гистограмм параметров карты эксцесса диффузии был применен к сгенерированным трехмерным областям интереса.Диагностическая точность была проанализирована с помощью анализа кривой рабочих характеристик приемника и комбинаций параметров ПЭТ и МРТ с использованием многомерной логистической регрессии.

Результаты

Параметры, полученные из карт эксцесса диффузной МРТ, показывают высокую диагностическую точность, до 88%, для различения TPR и TRC. Логистическая регрессия показала, что наивысшая диагностическая точность 94% (площадь под кривой 0,97; чувствительность 94%; специфичность 91%) была достигнута путем сочетания максимального отношения опухоли к мозгу ¹⁸ поглощения F-FET и показатели диффузного МРТ эксцесса.

Выводы

Комбинированное использование карт ¹⁸ F-FET ПЭТ и МРТ диффузионного эксцесса кажется многообещающим подходом для улучшения дифференциации TPR от TRC в предварительно обработанной глиобластоме и требует дальнейшего исследования.

Ключевые слова: аминокислоты ПЭТ, опухоль головного мозга, МРТ с диффузным эксцессом, псевдопрогрессия, прогрессирование опухоли

Ключевые моменты

• МРТ с диффузным эксцессом в FET-ПЭТ-положительных областях обеспечивает диагностическую точность 88% при рецидивирующих глиомах.

• Комбинация МРТ с диффузным эксцессом и ПЭТ на полевых транзисторах увеличивает точность диагностики до 94%.

Важность исследования

Дифференцировать прогрессирование опухоли от изменений, связанных с лечением, у пациентов с предварительно пролеченной глиобластомой сложно на основании только структурной МРТ. В этом исследовании исследуется комбинация ПЭТ с использованием индикатора аминокислот O — (2- [ ¹⁸ F] -фторэтил) -1-тирозин (FET) и микроструктурной информации, полученной с помощью визуализации диффузного эксцесса (DKI).Оба эти метода могут предоставить дополнительную информацию по этому клинически важному вопросу. Комбинация FET PET и DKI привела к высокой диагностической точности, требующей дальнейших исследований. Разработанный индекс FET / DKI предлагает простой способ применения этого подхода в клинической практике.

Из-за агрессивного инфильтративного роста и высокой частоты рецидивов глиобластома является самой смертельной опухолью головного мозга у взрослых, и, несмотря на максимальное лечение, только 5% пациентов с глиобластомой выживают в течение 5 лет или дольше после постановки диагноза. ¹ Диагностика прогрессирования опухоли (TPR), основанная только на стандартной МРТ, затруднена необходимостью дифференцировать TPR от неопухолевых, связанных с лечением изменений (TRC), таких как псевдопрогрессия или лучевой некроз. ² В частности, псевдопрогрессия проявляется в виде прогрессирующих или новых контрастных поражений, обычно в течение 3 месяцев после завершения лучевой терапии у 15–30% пациентов со злокачественной глиомой. ³ TRC часто имитируют TPR и, следовательно, имеют тенденцию мешать повседневному уходу за пациентом, что представляет собой критическую клиническую дилемму. ⁴ Несмотря на значительные усилия, уже предпринятые для улучшения оценки ответа и поддержки принятия клинических решений, ⁵ остро необходима дальнейшая разработка надежных визуализирующих биомаркеров для более точной диагностики TRC.

МРТ с контрастным усилением — метод выбора в нейроонкологии, играющий ключевую роль в диагностике и оценке реакции на лечение. ⁶ Однако обычная МРТ имеет ограниченную специфичность в дифференциации TPR от TRC, ⁴ , и основным недостатком анатомической МРТ является отсутствие метаболической информации.Напротив, ПЭТ с использованием радиоактивно меченных аминокислот, таких как O — (2- [ ¹⁸ F] -фторэтил) -1-тирозин ( ¹⁸ F-FET), является чувствительным инструментом для визуализации метаболической активности опухоли и может предоставить дополнительную информацию для улучшенной диагностики. ⁷ Рабочая группа по оценке ответа в нейроонкологии (RANO) и Европейская ассоциация нейроонкологов выступают за использование аминокислотной ПЭТ в качестве дополнительного инструмента к МРТ при лечении пациентов с опухолями головного мозга. ⁸ В частности, недавно было показано, что ¹⁸ F-FET PET способствует улучшенному дифференцированию TRC от TPR с высокой диагностической точностью в диапазоне 80–90%. ^9,10

Создание передовых методов МРТ представляет собой еще одну быстро развивающуюся область, имеющую отношение к нейроонкологии, ⁷ с диффузионной МРТ, которая чувствительна к микроструктурной архитектуре клеточной ткани и все чаще используется при оценке опухолей головного мозга. ¹¹ Кажущийся коэффициент диффузии, полученный из диффузионно-взвешенной или диффузно-тензорной визуализации (DTI) ¹² , имеет тенденцию обратно коррелировать с клеточностью опухоли ¹³ и был протестирован при оценке ответа на лечение ¹⁴ наряду с различением TRC от TPR. ¹⁵ Однако надежное использование средних показателей DTI в нейроонкологии часто ограничено из-за неоднородности внутриопухолевой микросреды, ¹⁶ признака большинства злокачественных новообразований головного мозга.С другой стороны, гистограммный анализ показателей DTI позволяет рассматривать более подробную информацию и, как было показано, обеспечивает дополнительную ценность при классификации глиом ¹⁷ и при мониторинге лечения. ^18–20

Дальнейшие перспективы, касающиеся диффузионной МРТ при опухолях головного мозга, связаны с текущим развитием новых методов многооболочечной диффузии, ^11,21 с использованием высоких значений b за пределами типичного диапазона DTI (≤1 мкм ² / мс).Эти методы обращаются к свойствам негауссовой диффузии воды в ткани и кодируют дополнительные микроструктурные особенности. В частности, визуализация диффузного эксцесса (DKI) ²² позволяет оценить метрики тензора диффузии (DT) и специфического тензора эксцесса (KT) из одного и того же измерения в клинически приемлемые сроки сбора данных. Следовательно, он привлекает растущий интерес к нейрорадиологии, сообщается о его применениях при инсульте, нейродегенеративных заболеваниях и опухолях, ^11,21,23 , и были обнаружены многообещающие биомаркеры для оценки степени глиомы и клеточной пролиферации. ^24,25

Небольшое количество исследований продемонстрировало потенциал комбинирования ¹⁸ F-FET PET с диффузионными и / или другими методами МРТ для обследования пациентов с опухолью головного мозга ^26,27 с помощью современного гибридного PET / МРТ-технологии. ²⁸ Также появляется все больше свидетельств того, что использование комбинации структурных и расширенных методов МРТ наряду с ¹⁸ F-FET PET может значительно повысить диагностическую точность для обнаружения TPR и прогнозирования ответа на лечение. ^3,27,29,30

Мы предполагаем, что поражения, демонстрирующие незначительное отклонение от нормы или повышенное ¹⁸ поглощение F-FET в области предполагаемого TPR, могут быть полезны для выявления областей с аномальными микроструктурными свойствами, которые затем могут быть дифференцированы. с использованием расширенных методов диффузной МРТ. Целью этого исследовательского гибридного исследования ПЭТ / МРТ было оценить параметры DT и KT в поражениях с повышенным поглощением ¹⁸ F-FET и оценить их точность в дифференциации TPR и TRC с использованием анализа гистограмм.

Материалы и методы

Пациенты

С февраля 2013 г. по март 2016 г. в исследование ретроспективно были включены 32 пациента с гистопатологически подтвержденной глиобластомой и клиническими признаками или результатами МРТ, указывающими на TPR на основе критериев RANO ⁸ . Все пациенты были обследованы с помощью гибридного сканера ПЭТ / МРТ и соответствовали следующим критериям включения: (1) гибрид ¹⁸ F-FET ПЭТ / МРТ с DKI и протоколом структурной МРТ визуализации опухоли головного мозга, (2) предварительная резекция опухоли или биопсия с последующей химиолучевой терапией темозоломидом (TMZ) и (3) данные повторной биопсии или последующего клинического наблюдения и данные визуализации, доступные как минимум через 6 месяцев после гибридных исследований ПЭТ / МРТ.Местный комитет по этике одобрил ретроспективный анализ данных. Никакого противоречия с Хельсинкской декларацией не было. Перед визуализацией все пациенты дали письменное информированное согласие на исследование ПЭТ и МРТ и использование полученных данных в научных целях. Более подробная информация о группе пациентов представлена ​​в дополнительной таблице S1.

Диагноз TRC или TPR был основан на критериях, определенных Young et al. ³¹ Если гистопатология без повторов была доступна (у 20 пациентов), клинический диагноз TRC или TPR был установлен на основе консенсуса 2 опытных нейроонкологов на основе полного обзора диаграммы и обзора МРТ после наблюдения.Диагноз TRC предполагался, если не требовалось никаких изменений в лечении в течение как минимум 6 месяцев после ПЭТ / МРТ.

Все пациенты были сканированы с использованием гибридного 3T-сканера ПЭТ / МРТ с высоким разрешением (BrainPET, Siemens Healthcare, осевое поле зрения, 19,2 см). Данные изображения были скорректированы на случайные совпадения и совпадения по разбросу, а также на мертвое время до реконструкции OP-OSEM, предоставленной производителем (2 подмножества, 32 итерации). Восстановленный набор динамических данных состоял из 16 временных кадров (5 × 1 мин; 5 × 3 мин; 6 × 5 мин).Поскольку гибридный сканер ПЭТ / МРТ не обеспечивает источник передачи, коррекция затухания проводилась на основе шаблона с использованием МРТ. ³⁰

¹⁸ Данные ПЭТ с F-FET были применены и проанализированы, как описано ранее. ³² Вкратце, исследования динамической ПЭТ проводились в течение 50 минут после внутривенной инъекции приблизительно 3 МБк ¹⁸ F-FET / кг массы тела. Среднее поглощение ¹⁸ F-FET в опухоли определяли с помощью двумерного (2D) процесса авто-контурирования с использованием отношения опухоли к мозгу (TBR) не менее 1.6 в суммированных ¹⁸ ПЭТ-изображениях F-FET через 20-40 минут после инъекции. Для расчета максимального поглощения аминокислот круговая интересующая область (ROI) диаметром 1,6 см была сосредоточена на максимальном поглощении опухолью. Средние и максимальные TBR (TBR _{среднее} и TBR _max ) рассчитывались путем деления среднего и максимального стандартизованного значения поглощения (SUV) ROI опухоли на среднее SUV здоровой ткани мозга. Кривые время-активность (ТАС) захвата ¹⁸ F-FET в опухоли были получены путем нанесения интересующего сферического объема объемом 2 мл (диаметр 1.6 см) ко всему динамическому набору данных. Значения времени до пика, полученные из TAC (TTP; минимум от начала динамического сбора данных до максимального SUV поражения) и наклона TAC поглощения ¹⁸ F-FET, были рассчитаны с помощью аппроксимации линия линейной регрессии к поздней фазе кривой (20–50 мин после инъекции). Наклон выражался в смене внедорожника в час.

Протокол получения МРТ

Протокол МРТ, используемый с гибридным сканером ПЭТ / МРТ, включал последовательность быстрого градиентного эхо-сигнала (MP-RAGE), взвешенную по T _1, , взвешенную по намагниченности (MP-RAGE), T ₂ -взвешенную инверсию с ослаблением жидкости последовательность восстановления, и последовательность MP-RAGE с усиленным контрастом T ₁ (CE-T ₁ ), проведенная после инъекции контрастного вещества, гадотериновой кислоты (Dotarem; Guerbet) в дозе 0.1–0,2 ммоль / кг массы тела. ³³ Диффузионная последовательность МРТ имела следующие параметры сбора: TR / TE = 9700/105 мс; полоса пропускания = 1594 Гц / пикс; b значения = 0, 1000, 2500 с / мм ² ; количество средних = 2; количество направлений градиента = 30; размер вокселя = 2 × 2 × 2 мм ³ ; размер матрицы = 112 × 112 × 68.

Обработка изображений DKI

МРТ-изображения, взвешенные по диффузии, были скорректированы на вихретоковые искажения и движение головы с использованием инструмента «Eddy-corrective», доступного в FSL; Направления градиентного поля были переориентированы ³⁴ с использованием собственных скриптов Matlab (R2014a, 2014, The Mathworks Inc.). Положительное смещение в сигнале было скорректировано с использованием метода изображений мощности, ^35,36 со стандартным отклонением фонового шума, оцененным с использованием подхода Aja-Fernández et al. ³⁷ и далее упорядочены с помощью ExploreDTI. ³⁸ Анализ DKI был выполнен с использованием нелинейной оценки методом наименьших квадратов, доступной в ExploreDTI. Наконец, показатели DT (средняя / радиальная / осевая диффузионность, MD / RD / AD) и конкретные KT (средний / радиальный / осевой куртоз, MK / RK / AK) были оценены с помощью ExploreDTI.

Совместная регистрация изображений и сегментация опухоли были выполнены с помощью инструмента анализа ПЭТ / МРТ мозга программного обеспечения PMOD (версия 3.707, 2015, PMOD Technologies Ltd) сертифицированными радиологами (F.M. и C.F.). Изображения ПЭТ были совместно зарегистрированы посредством жесткого сопоставления с нормализованной взаимной информацией с использованием алгоритма сглаживания по Гауссу, примененного к Т ₁ -взвешенной 3-мерной (3D) МРТ с повышенным контрастом. Карты параметров DT / KT были впоследствии зарегистрированы в CE-T ₁ посредством аффинной регистрации твердого тела с нормализованной взаимной информацией в качестве функции стоимости.3D области интереса были полуавтоматически сегментированы на изображениях ПЭТ с использованием порогового значения TBR 1,6. ³⁹ После этого были извлечены соответствующие трехмерные области интереса на основе вокселей за вокселями для всех показателей DT / KT из карт параметров и использованы для генерации гистограмм. 2D области интереса были нарисованы на картах параметров DT / KT в противоположном нормальном белом веществе, на уровне полуовального центра, избегая пространств CSF и побочных продуктов крови, если они присутствуют. Два читателя (F.D. и G.B.) оценили точность совместных регистраций и отсутствие видимых искажений.

Анализ гистограммы показателей DT и KT

Анализ гистограммы был выполнен для наборов данных DT / KT 3D ROI с использованием Matlab и собственных скриптов. Значения интенсивности вокселей вне диапазона 0,5–3,5 мкм ² / мс для карт DT и вне диапазона 0,4–1,2 для карт KT были отброшены, чтобы уменьшить влияние зашумленных точек. Гистограммы относительной частоты были сгенерированы для каждого субъекта после нормализации индивидуальных гистограмм вокселов на интервал по объему соответствующей трехмерной области интереса.Сглаживание гистограммы выполнялось с использованием окна скользящего среднего 0,14 мкм ² / мс для DT и 0,04 для гистограмм KT. Средние значения гистограммы и центили (C5, C10 для DT и C90, C95 для карт KT) были извлечены из гистограммы каждого отдельного субъекта, таким образом, получив в общей сложности 18 переменных DT / KT. Нормализация параметров гистограммы к значениям контралатеральных областей интереса белого вещества с нормальным внешним видом не проводилась, поскольку межгрупповые различия в этих областях не были значительными (дополнительная таблица S2).

Статистический анализ

Статистический анализ выполняли с использованием программного обеспечения MedCalc (c17.2, MedCalc Software Bvba, 2017). Нормальность распределения переменных оценивалась с помощью критерия Колмогорова – Смирнова. Межгрупповые различия в средних значениях параметров DT / KT, относящихся к 2D ROI в нормальном белом веществе, параметрах гистограммы 3D ROI для показателей DT / KT и ¹⁸ параметров F-FET PET (TBR _max , TBR _{среднее} , TTP, slope) сравнивали с помощью U-критерия Манна – Уитни.

Параметры гистограммы 3D ROI для показателей DT / KT считались значимыми для P ≤ 0,0028 = 0,05 / 18, где значение α было установлено с использованием поправки Бонферрони для множественных сравнений ( n = 18). Сравнение 4 ¹⁸ параметров ПЭТ с F-FET считалось значимым для P ≤ 0,0125 = 0,05 / 4. Учитывая исследовательский характер данной работы и ограничительный характер поправки Бонферрони, мы дополнительно рассматривали нескорректированное α = 0.05 и обратитесь к результатам с 0,003 < P ≤ 0,05 для показателей DT / KT и с 0,0125 < P ≤ 0,05 как «значимым до коррекции». ⁴⁰ Возможные ассоциации между переменными игнорировались, поскольку основной целью этого исследования было выявление наиболее многообещающих биомаркеров.

Кривые рабочих характеристик приемника (ROC) использовались для оценки площадей под кривой ROC (AUC) и для поиска оптимальных значений отсечки параметров гистограммы.Учитывались только параметры, которые были статистически значимыми при межгрупповых сравнениях. Статистически значимые различия между AUC были исследованы с использованием методологии Делонга с точным биномиальным 95% доверительным интервалом.

Одномерные логистические регрессии с «диагнозом» в качестве зависимой бинарной переменной использовались для проверки прогностической способности параметров гистограммы DT / KT, которые были значимыми согласно результатам U-критерия Манна – Уитни. Наконец, чтобы определить комбинации параметров, которые могут более точно предсказать TPR по сравнению с отдельными параметрами, была построена модель многомерной логистической регрессии с диагнозом в качестве зависимой переменной.Коэффициенты регрессии для MK C90 (4,7) и TBR _max (39,2) в дальнейшем использовались в качестве весовых коэффициентов для получения единого клинически применимого индекса FET – DKI для дифференциации между TPR и TRC следующим образом:

Индекс FET-DKI = 4,7 × TBRmax + 39,2 × MKC90.

(1)

Результаты

Одиннадцать пациентов были отнесены к группе TRC, а 21 пациент — к группе TPR. Диагноз был поставлен на основании гистопатологического исследования в 12 случаях и результатов клинического наблюдения в 20 случаях.У одного пациента из группы TRC в анамнезе был рецидив до ПЭТ / МРТ, в то время как у 11 пациентов из группы TPR был один или несколько рецидивов. Вся когорта подверглась хирургическому вмешательству и одновременной химиолучевой терапии TMZ плюс адъювантная TMZ в качестве терапии первой линии. Бевацизумаб второй линии (BEV) применялся отдельно или в комбинации с другими препаратами у 3 пациентов. На момент проведения ПЭТ / МРТ 17 пациентов получали TMZ, 1 пациент из группы TPR лечился BEV, а 14 пациентов не получали терапию (дополнительная таблица S1).

Статистически значимое ( P <0,0028) увеличение было обнаружено для всех параметров гистограммы показателей KT в TPR по сравнению с группой TRC, за исключением AK C90 и AK C95 (которые были значимыми до коррекции, P ≤ 0,05). Параметры гистограммы показателей DT не достигли статистической значимости ( P > 0,008) после поправки Бонферрони. Однако стоит отметить, что показатели DT показали явную тенденцию к снижению в группе TPR, и 4 из них (среднее RD, RD C5, RD C10 и MD C10) были значительными до коррекции ( P ≤.05). Не было значимой разницы в параметрах ¹⁸ F-FET PET: TBR _{, среднее значение} , TTP и крутизна между группами, тогда как TBR _max было значительно ниже в TRC. предоставляет сводку медиан и межквартильного диапазона, оцененных для параметров гистограммы 3D ROI DT / KT и параметров ПЭТ ¹⁸ F-FET для обеих групп, а также значения P межгрупповых сравнений.

Таблица 1.

Сравнение показателей DT / KT (верхняя панель) и ¹⁸ параметров F-FET PET (нижняя панель) в группах TRC и TPR

Примеры ¹⁸ поглощения F-FET, CE-T ₁ , карты параметров DT / KT и соответствующие гистограммы к областям интереса, выделенным на картах для одного репрезентативного пациента из каждой группы TRC и TPR, показаны в и, соответственно. У пациента TRC () гистограммы коэффициента диффузии представляют собой большие области с более высокими значениями, тогда как гистограммы KT явно смещены в сторону более низких значений по сравнению с пациентом из группы TPR ().Соответственно, на уровне группы кумулятивные гистограммы относительной частоты параметров DT / KT в группе TPR кажутся смещенными в сторону более низких коэффициентов диффузии и более высоких значений диффузионного куртоза по сравнению с группой TRC ().

Примеры захвата ¹⁸ F-FET, МРТ CE-T ₁ и карты параметров DT / KT (A), а также гистограммы, соответствующие областям интереса, выделенным на картах для пациента с TRC (B).

Примеры захвата ¹⁸ F-FET, МРТ CE-T ₁ и карты параметров DT / KT (A), а также гистограммы, соответствующие областям интереса, выделенным на картах для пациента с TPR (B).

Примеры кумулятивных относительных частотных гистограмм параметров DT (MD / RD / AD) и KT (MK / RK / AK), показывающих сдвиги в сторону более низких значений коэффициента диффузии и более высоких значений диффузионного эксцесса в TPR по сравнению с группой TRC .

Значение отсечки MK C90, равное 0,62, дало наибольшее значение AUC = 0,87 ( P <0,0001) с чувствительностью 100%, специфичностью 64% и точностью 88%. Чувствительность 100% также была достигнута по среднему значению МК и RK C90, показывающему AUC равным 0.85 ( P <.0001) и 0,83 ( P = .0001) соответственно. Наибольшая специфичность (91%) наблюдалась у МК C95 с AUC 0,86 ( P <0,0001). AUC существенно не различались между параметрами KT ( P > 0,05). ROC-анализ для TBR _max , единственного значимого параметра среди показателей ¹⁸ F-FET PET, дал пороговое значение 2,95 и AUC 0,77 ( P = 0,003) с чувствительностью 71%, специфичностью. 73% и точность 72%.

Модель многомерной логистической регрессии была протестирована для комбинации показателей с наивысшими правильными показателями классификации в каждом из DKI и ¹⁸ наборов параметров F-FET PET (т. Е. Среднее MK, MK C90 и TBR _max ), а также для различных комбинаций параметров DKI и ¹⁸ F-FET PET, которые были значимыми при межгрупповых сравнениях. Однако, поскольку ни одна из последних комбинаций не дала лучшей диагностической точности, чем комбинация MK C90 и TBR _max , эти тесты не рассматривались в дальнейшем анализе.Комбинация MK C90 и TBR _max дала наивысшую диагностическую точность (94%) с AUC 0,97 (, нижняя панель). ROC-анализ одного индекса FET – DKI (уравнение 1) дал порог более 41 для определения TPR, что дало AUC 0,97, чувствительность 95%, специфичность 91% и точность 94%. для различения TPR и TRC. суммирует результаты анализа кривой ROC и логистической регрессии для параметров гистограммы показателей KT и TBR _max из ¹⁸ поглощения F-FET.Результаты анализа ROC для дифференциации между группами TPR и TRC визуализированы для MK C90 (красный), TBR _max (зеленый) и индекса FET – DKI (черный) для сравнения.

Таблица 2.

Диагностическая точность параметров гистограммы KT и TBR _max FET PET для дифференциации между TRC и TPR по оценке ROC и одномерного логистического регрессионного анализа (верхняя панель) и многомерной логистической регрессии (нижняя часть). Панель): AUC, значения отсечения, значения 95% ДИ в скобках, чувствительность, специфичность и значения P

Обсуждение

Основной результат нашего исследовательского исследования показывает, что использование комбинированной информации, относящейся к транспорту аминокислот с помощью ¹⁸ F-FET PET и микроструктурной информации из диффузионной МРТ, может предложить синергетические преимущества для клинической практики при решении проблемы различения между TPR и TRC.То есть для пациентов с подозрением на рецидив глиобластомы области мозга с повышенным поглощением ¹⁸ F-FET демонстрируют микроструктурные различия, которые могут быть зафиксированы параметрами гистограммы KT, что позволяет дифференцировать TPR и TRC с высокой диагностической точностью. Еще один важный вывод заключается в том, что показатели KT в областях с высоким уровнем потребления ¹⁸ F-FET существенно превосходят показатели DT при различении TPR и TRC. Этот вывод согласуется с ранее сообщавшейся более высокой чувствительностью показателей KT при характеристике различных патологических состояний мозга. ^41,42 Кроме того, многомерный логистический регрессионный анализ показал, что различие между TPR и TRC может быть улучшено за счет комбинации параметров гистограммы KT и TBR _max . Основываясь на этом результате, мы сгенерировали единый надежный индекс FET – DKI, суммируя взвешенные значения TBR _max и MK C90 (уравнение 1). Индекс FET – DKI позволил дифференцировать TPR и TRC с AUC 0,97 при пороговом значении 41 и, таким образом, может быть полезен при принятии клинических решений.Мы хотели бы подчеркнуть, что высокая производительность показателей KT и комбинированного подхода FET – DKI, наблюдаемая в этой работе, может быть связана, с одной стороны, с сегментацией поражений по областям с повышенным поглощением ¹⁸ F-FET а не на МРТ с контрастным усилением и, с другой стороны, к применению анализа гистограмм, уменьшая усредняющие эффекты либо TPR, либо неоднородности поражения, модулируемой лечением.

Наши результаты, касающиеся параметров DT / KT, требуют обсуждения в контексте современной литературы.Что касается белого вещества нормального вида, значения коэффициентов диффузии и диффузионного куртоза, наблюдаемые в этой работе, находились в диапазоне значений, наблюдаемых в предыдущих исследованиях. ^24,25 На сегодняшний день лишь в небольшом количестве исследований гистограмма DKI применялась к пациентам с опухолями головного мозга. ^43,44 Эти исследования, однако, были сосредоточены в первую очередь на оценке глиомы, поэтому прямое сравнение с нашими результатами невозможно. Тем не менее, в нескольких исследованиях изучалась роль обычного DTI в дифференциации TPR от TRC ^30,45,46 , при этом большинство данных указывает на недостаточную диагностическую точность.В нашем исследовании наблюдалась четкая тенденция к более низким значениям коэффициента диффузии в группе TPR; однако ни один из показателей DT не достиг статистической значимости при межгрупповой дифференциации.

Положительная корреляция между показателями эксцесса и Ki-67, маркером клеточной пролиферации, была обнаружена Jiang et al., ²⁵ , предполагая, что более высокая клеточность в сочетании с другими клеточными, субклеточными и внеклеточными изменениями способствует увеличению микроструктурных изменений. сложность опухолевой ткани.Аналогичным образом Hempel et al. ⁴¹ недавно обнаружил значительные вариации МК в зависимости от молекулярных подтипов глиом с хорошо известными различиями в гистологических особенностях. В более общем плане предполагается, что за исключением наиболее простых количественных параметров, таких как плотность клеток, различные дополнительные характеристики (размер, форма, соотношение нуклеоплазмы и цитоплазмы и т. Д.) Опухолевых клеток ⁴⁷ и состав внеклеточного матрикса ⁴⁸ также может влиять на диффузию воды.

Результаты показывают, что многокомпонентное нарушение микросреды после лечения ⁴⁹ приводит к более низкому диффузионному эксцессу в TRC по сравнению с плотно организованными пучками аксонов нормального белого вещества. Напротив, в TPR пролиферирующие и вторгающиеся / инфильтрирующие клетки и извилистость внеклеточного пространства приводят к более высокому эксцессу, чем в TRC, но не так высокому, как в нормальном белом веществе. Различное сочетание признаков, предполагающих TPR и TRC, обычно регистрируется при гистологии. ⁴⁹ В этом отношении наш новый подход к определению ROI на основе ¹⁸ F-FET PET позволил нам сосредоточиться на метаболически активной ткани, тем самым отбросив «чистый» вазогенный перилезионный отек и неспецифическое нарушение гематоэнцефалического барьера, в то же время включая окружающие нормальные — паренхима на МРТ, которая, однако, показала выше порогового значения ¹⁸ поглощение F-FET на ПЭТ. Кроме того, поскольку диффузионный сигнал может колебаться во время и после терапии, что приводит к путанице в интерпретации при измерении в один момент времени, ^18,48 метаболическая информация, предоставляемая ¹⁸ F-FET PET, также может помочь в уменьшении мешающих факторов.

В настоящем исследовании для выявления метаболически аномальной ткани использовался порог поглощения ¹⁸ F-FET на 1,6 или более выше фона. Этот порог был определен в необработанных глиомах, чтобы лучше дифференцировать ткань глиомы от перитуморальной ткани. ⁸ Однако в посттерапевтической ситуации реактивные изменения в ткани, такие как реактивный астроцитоз, приводят к умеренному увеличению поглощения F-FET на ¹⁸ , так что 3D ROI, используемый в этом исследовании, вероятно, включает как TPR, так и TRC.Тем не менее, ¹⁸ F-FET PET показал хорошую диагностическую точность при различении TRC и TPR. ^9,29 Наши результаты согласуются с опубликованными, ^9,29 , хотя мы не обнаружили значительных различий для TBR _{, среднее значение} , что может быть связано с относительно небольшим размером выборки в нашем исследовании.

Ограничения этой работы относятся к относительно небольшому количеству пациентов, отсутствию набора для валидации, моноцентрическому подходу, небольшому количеству биопсий в группе TRC, широкому диапазону времени после различных процедур, что может помешать обобщаемость результатов.Кроме того, антиангиогенные препараты или кортикостероиды могут оказывать влияние, особенно на усиление контрастности при МРТ, то есть проницаемость гематоэнцефалического барьера. Однако поглощение ¹⁸ F-FET, которое использовалось для определения ROI, не зависит от нарушения BBB. Следовательно, влияние этих препаратов на результаты маловероятно. Более того, существует систематическая ошибка отбора, поскольку на ¹⁸ F-FET PET направляются только пациенты, у которых диагноз неясен на основании обычных МРТ и клинических параметров.Таким образом, коллектив представляет проблемные случаи в клинической практике, что усиливает достоверность результатов. Тем не менее, дальнейшие исследования с невропатологической проверкой результатов нейровизуализации у большего числа пациентов необходимы для подтверждения наших результатов.

В заключение, наши результаты показывают, что совместное использование аминокислотного ПЭТ с использованием индикатора ¹⁸ F-FET и анализа гистограммы KT может помочь точно определить различия между TPR и TRC.Было продемонстрировано, что анализ гистограммы KT имеет потенциальную ценность при определении тонких различий в визуализации между прогрессирующей глиобластомой и TRC и работает лучше, чем показатели DT. Более высокая диагностическая точность была получена путем объединения ¹⁸ F-FET PET (TBR _max ) и центилей гистограммы KT более высокого уровня (MK C90) по сравнению с автономными метриками ¹⁸ F-FET PET и DT / KT. . Таким образом, комбинированный анализ аминокислот с помощью ПЭТ и расширенной МРТ дает больше диагностической информации, чем любой метод по отдельности.В будущих исследованиях следует искать аномалии диффузии в субрегионах опухолей с максимальным поглощением ¹⁸ F-FET и проводить сравнения с гистомолекулярными данными, чтобы пролить больше света на их взаимосвязь с микроструктурными и морфологическими особенностями среды обитания опухоли с наибольшей плотностью клеток.

Дополнительные материалы

vdab044_suppl_Supplementary_Table_S1

vdab044_suppl_Supplementary_Table_S2

Благодарности

Авторы благодарят Петру Энгельс, Эльзан Фреанзен, пациентку Сьюзан Фрехтсхолц, Эльзан Бехтхенц, пациента исследования; Йоханнес Эрмерт, Силке Графмюллер, Эрика Ваббалс и Саша Ребейн за радиосинтез ¹⁸ F-FET; Клэр Рик за вычитку рукописи.

Заявление о конфликте интересов . Конфликт интересов не требуется.

Заявление об авторстве

Схема эксперимента: F.D., F.G., N.J.S., and K.-J.L .; реализация: F.D., F.G., N.G., C.F., E.F. и G.S; анализ данных: F.D., F.G., J.M., G.B., E.F., C.F. и P.L .; интерпретация: F.D., F.G., N.G., G.B., P.L., N.J.S., F.M.M. и K.-J.L .; в письменной форме участвовали: все; прочитал и одобрил: все.

Список литературы

Неинвазивные маркеры фиброза печени | BMC Gastroenterology

Границы | Гетерологичная иммунизация вакцинами с определенной РНК и субъединицей усиливает Т-клеточные ответы, защищающие от Leishmania donovani

Введение

Очень важно, чтобы мы разработали эффективные меры по противодействию инфекционным агентам, которые продолжают появляться (1). Технология РНК-вакцины продемонстрировала свою способность вызывать ответные реакции антител и, таким образом, способность вызывать быстрые ответы на несколько возникающих патогенов (2–5).Относительная простота в разработке и производстве вакцин на основе нуклеиновых кислот также предполагает потенциал для недорогого и отчасти генерического производства, и для некоторых целей были разработаны надежные производственные процессы (4). Среди стратегий, используемых для усиления иммуногенной природы вакцин с нуклеиновыми кислотами, была адаптация вектора нуклеиновой кислоты для обеспечения нацеливания на врожденную иммунную систему для усиления последующих адаптивных ответов и манипулирование системами доставки для обеспечения эффективной трансфекции клеток-хозяев in vivo .Хотя вирусные векторы, такие как конструкции на основе альфа- и лентивирусов, также сильно активируют Т-клетки, меньше известно о том, как технология РНК-вакцины может быть использована для индукции и характеристики Т-клеточных ответов против внутриклеточных патогенов.

Leishmania donovani — важный патоген для человека, который может проявляться висцеральным лейшманиозом (ВЛ). Подсчитано, что до 90% людей, инфицированных L. donovani , остаются в бессимптомном состоянии с эффективным антигенспецифическим Т-клеточным ответом, имеющим решающее значение для сдерживания инфекции и предотвращения перехода к ВН (6).Экспериментальная инфекция мышей Leishmania расширила наши представления о вспомогательных Т-клетках во время инфекции и позволила разделить парадигму Th2 / Th3 (7–9). Кроме того, поскольку защита обеспечивается клетками Th2 в устойчивых штаммах, а чувствительность индуцируется клетками Th3 в чувствительных штаммах, эти модели выявили генетические механизмы, участвующие в развитии заболевания (7, 10–12). Эти экспериментальные данные весьма актуальны, поскольку CD4-Т-клетки бессимптомных инфицированных индивидуумов продуцируют IFNγ в клетке L.donovani антиген-специфическим образом (13–20). Также есть доказательства того, что взаимодействие с CD8 Т-клетками также может участвовать в защите как в экспериментальных, так и в физиологических ситуациях (17, 21, 22). Учитывая, что они хорошо описаны, модели инфекции Leishmania представляют собой контролируемые экспериментальные системы для оценки вакцин, индуцирующих Т-клетки (23). На сегодняшний день мы произвели несколько определенных субъединичных вакцин, состоящих из рекомбинантных слитых белков, соответствующим образом составленных с адъювантом, которые вызывают защитные Th2-ответы (24–26).

Учитывая важность антигенспецифических Т-клеток в борьбе с несколькими возникающими инфекционными заболеваниями, мы решили использовать слитые белки LEISH-F2 и LEISH-F3 + в качестве известных антигенных мишеней, чтобы определить, можем ли мы быстро произвести вакцины-кандидаты, способные повышать защитные свойства организма. Ответы Т-клеток. Мы разработали РНК-репликон на основе альфавируса, экспрессирующий гены F2 и F3 + (F2-РНК и F3 + РНК, соответственно), а затем оценили их способность дополнять активность определенной субъединицы (рекомбинантный белок с глюкопиранозиллипидом A второго поколения в стабильной маслосодержащей среде). -водная эмульсия; SLA-SE) вакцины для быстрого и сильного образования антиген-специфических Т-клеточных ответов.

Материалы и методы

Репликон РНК

Плазмида, кодирующая 5 ‘и 3’ нетранслируемые области и неструктурные гены штамма TC-83 вируса венесуэльского конского энцефалита (VEEV), была использована в качестве основы репликона, как описано ранее (27). Последовательности генов для конструкций LEISH-F2 и LEISH-F3 + были оптимизированы по кодонам, синтезированы и клонированы в вектор pUC57 по сайтам NotI и SphI с помощью Genscript (Piscataway, NJ). Лиофилизированную ДНК восстанавливали в дистиллированной воде и расщепляли NotI-SphI, затем клонировали в репликон Tc83.ДНК репликона линеаризовали ферментативным расщеплением сначала NotI, затем протеиназой K, с последующей обработкой фенолом хлороформом и осаждением этанолом. Плазмиду транскрибировали с использованием набора для транскрипции MEGAscript ^® T7 (Invitrogen, Carlsbad, CA) с последующим кэппированием системой NEB Vaccinia Capping System. Экспрессию вставки подтверждали вестерн-блоттингом. Вкратце, 2 мкл клеточного лизата загружали и обрабатывали трис-глициновым гелем, а затем переносили на нитроцеллюлозную бумагу. Перенесенную нитроцеллюлозную бумагу затем инкубировали с кроличьей сывороткой против F2 в 5% сухом молочном фосфатно-солевом буферном растворе — Твин (PBST) с последующим обнаружением с использованием козьего антикроличьего IgG (Southern Biotech, Birmingham, AL 4050-05).

Стимуляция клеток

HEK293-Blue-TLR2, -TLR3, -TLR4, -TLR7 или нулевые клетки (все из InvivoGen, Сан-Диего, Калифорния) поддерживали в среде для культивирования клеток DMEM + GlutaMax, содержащей 10% FCS, 1% пенициллин и стрептомицин 50. мкг / мл неомицина и селективные антибиотики (HEK-Blue ™ Selection, Blasticidin или Zeocin; InvivoGen). Клетки не обрабатывали или обрабатывали смесью Lipofectamine ™ 3000 (Invitrogen) и F2 или контрольными конструкциями РНК. Для стимуляции клетки высевали в 96-луночные планшеты в концентрации 2.5–5 × 10 ⁵ клеток на мл в среде для обнаружения HEK-Blue ™ (InvivoGen), затем инкубируют с соответствующими агонистами TLR. Активация индуцировала экспрессию SEAP (секретируемой эмбриональной щелочной фосфатазы), и ее измеряли спектрофотометрически при OD650 нм.

Мыши

Самок мышей C57BL / 6 (приобретенных в Charles River Laboratories, Уилмингтон, Массачусетс) и TLR7 — / — (приобретенных в Jackson Laboratories, Бар-Харбор, Мэн) содержали в определенных условиях, свободных от патогенов, и в соответствии с процедурами для животных, утвержденными Комитет IDRI по уходу за животными и их использованию.Мыши начали эксперименты в возрасте 6-8 недель.

Анализ дренирующих лимфатических узлов

Мышам вводили 20 мкл вакцины в икроножную мышцу. РНК-вакцина была приготовлена ​​таким образом, чтобы обеспечить общую дозу 10 мкг. SLA-SE вводили в дозе 5 мкг на инъекцию, чтобы служить положительным контролем иммунной активации. В разное время после инъекции дренирующий лимфатический узел вырезали и готовили суспензии единичных клеток. Мононуклеарные клетки подсчитывали с использованием анализа ViaCount с системой PCA (Guava Technologies, Hayward, CA).

Прививки

Мышей иммунизировали путем внутримышечной инъекции вакцины в бедро.

Рекомбинантные слитые белки LEISH-F2 и LEISH-F3 + были сконструированы путем выравнивания последовательностей отдельных генов в виде единого продукта, который затем был клонирован и экспрессирован в E. coli , как описано ранее (28, 29). Фракции очищенного аффинно белка анализировали электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и количественно определяли с помощью анализа белка BCA (Pierce, Rockford, IL).Уровни эндотоксина измеряли с помощью анализа Limulus Amebocyte Lysate QCL-1000 (Lonza Inc., Базель, Швейцария), и каждый из них был <100 EU / мг белка. Рекомбинантная антиген-содержащая вакцина (F2 или F3 + с SLA-SE) была приготовлена ​​для обеспечения всего 5 мкг белка и 5 мкг SLA на инъекцию. Предполагаемое компактное связывание SLA с TLR4, по-видимому, приводит к профилю цитокинов, более напоминающему TRIF-зависимую передачу сигналов по сравнению с альтернативным TLR4L глюкопиранозиллипидным адъювантом (GLA) (30). Были приготовлены конструкции РНК, чтобы обеспечить общую дозу 10 мкг.Каждая вакцина доставлялась в общем объеме 100 мкл, разделенном до объема 50 мкл на каждое бедро. Гомологичные и гетерологичные схемы первичной бустерной иммунизации с этими двумя вакцинами включали событие прайминга, за которым через 3 недели следовала бустерная иммунизация.

Ответы антиген-специфических антител

Кровь была взята из ретро-глазничной пазухи и подготовлена ​​сыворотка. Антиген-специфические ответы IgG выявляли с помощью иммуноферментного анализа (ELISA). Вкратце, планшеты для ELISA (Nunc, Rochester, NY) были покрыты 1 мкг / мл антигена в 0.1 М бикарбонатного буфера и блокировали 0,1% BSA-PBS. Затем, в последовательном порядке и после промывок в PBS / Tween, серийно разведенных образцов сыворотки, антител к мышиным IgG-HRP (Southern Biotech, Бирмингем, AL) и ABTS-H ₂ O ₂ (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg , MD). Планшеты анализировали при 405 нм (EL _X 808, Bio-Tek Instruments Inc, Winooski, VT). Конечный титр определяли как последнее значение оптической плотности (OD), превышающее пороговое значение, определенное сыворотками от контрольных мышей, иммунизированных физиологическим раствором.

Секреция антиген-специфических цитокинов

Селезенки удаляли через 4 недели после последней иммунизации и получали суспензии единичных клеток. Клетки культивировали в количестве 2 × 10 ⁵ клеток на лунку в двух экземплярах в 96-луночном планшете (Corning Incorporated, Corning, NY) в RPMI-1640 с добавлением 5% термоинактивированной FCS и 50000 единиц пенициллина / стрептомицина (Invitrogen). . Антиген-специфический ответ на возврат определяли путем инкубации клеток с 10 мкг / мл рекомбинантного белка или пептидов, ограниченных MHCI, в течение 3 дней перед сбором культурального супернатанта.Содержание цитокинов (IL-5 и IFNγ) в супернатанте измеряли с помощью ELISA в соответствии с инструкциями производителей (eBioscience, Inc., Сан-Диего, Калифорния).

Проточная цитометрия

Для определения состава иммунных клеток дренирующих лимфатических узлов (DLN) были приготовлены суспензии отдельных клеток и инкубированы с блоком рецептора Fc (clone2.4G2) перед инкубацией при комнатной температуре в течение 30 минут со следующими антителами: анти-CD4 (клон RM4 -5), анти-CD8a-FITC (клон 53-6.7), анти-CD11b (клон M1 / ​​70), анти-CD11c (клон N418), анти-CD19 (клон 1D3), анти-F4 / 80 (клон BM8 ) и анти-Ly6G (клон 1A8).Экспрессию выбранных поверхностных молекул определяли путем инкубации с анти-CD69 (клон h2.2F3) и анти-CD80 (клон 16-10A1). Антитела были приобретены у BD Biosciences, eBioscience, BioLegend или Tonbo Biosciences.

Антиген-специфические Т-клеточные ответы памяти, вызванные вакцинацией, определяли после инкубации клеток селезенки с 10 мкг / мл рекомбинантного белка F2. Клетки культивировали в количестве 1 × 10 ⁶ клеток на лунку в двух экземплярах в 96-луночном планшете (Corning Incorporated, Corning, NY) в RPMI-1,640 с добавлением 5% термоинактивированной FCS и 50000 единиц пенициллина / стрептомицина (Invitrogen). в течение 18–20 ч в присутствии GolgiStop (BD Bioscience).Каждый образец инкубировали с блоком рецептора Fc (клон 2,4G2) перед инкубацией при комнатной температуре в течение 30 мин со следующими антителами: анти-CD4 (клон RM4-5), анти-CD8a-FITC (клон 53-6,7) и анти-CD4. -CD44 (клон IM7). Экспрессию выбранных цитокинов определяли путем инкубации с анти-IFNγ (клон XMG1.2), анти-IL-2 (клон JES6-5h5), анти-CD154 (клон МРТ), анти-TNFα (клон MP6-XT22), анти-IL-2. -IL-5 (клон TRFK5) и анти-гранзим B (NGZB). Антитела были приобретены у BD Biosciences, eBioscience, BioLegend или Tonbo Biosciences.Данные были получены с помощью Fortessa (BD Biosciences) и проанализированы с помощью программного обеспечения FlowJo (FlowJo, LLC).

Мышей инфицировали инъекцией 1 × 10 ⁶ L. donovani (MHOM / SD / 00 / 1S-2D) в ретроорбитальный синус. Через четыре недели печень собирали и гомогенизировали. ДНК экстрагировали из гомогената с использованием мини-наборов QIAmp DNA (Qiagen) и количественно определяли с помощью спектрофотометра Nanodrop UV-Vis (ND-1000). Л.ДНК donovani затем была обнаружена с помощью ПЦР в реальном времени с использованием праймеров для L42486 (прямой, 5′-GCGACGTCCGTGGAAAGAA-3 ‘; и обратный, 5′-GGCGGGTACACATTAGCAGAA-3′) с репортерной последовательностью FAM (5’- CAACGCG’TATTCCC-3 который обнаруживает область геномного повтора длиной 203 п.н., специфичную для видов Leishmania (NCBI Blastn). Mouse Gapdh FAM (Life Technologies) использовали в качестве внутреннего эталонного контроля. Количество паразитов на мкл ДНК определяли путем экстраполяции точек пересечения (Cps) каждого образца на стандартную кривую, построенную для известных количеств паразитов, а затем нагрузки, выраженные как паразитов на орган.

Статистический анализ

Статистический анализ проводился с использованием одностороннего дисперсионного анализа и критериев множественного сравнения Даннета или Тьюки, используемых для сравнения двух групп. Статистическую значимость считали, когда значения p были <0,05.

Результаты

РНК F2 индуцирует транслокацию NF-κB через участие TLR7

Чтобы определить, может ли F2-РНК способствовать активности через известные рецепторы врожденного иммунитета, клетки HEK293-Blue, экспрессирующие различные Toll-подобные рецепторы (TLR) человека, инкубировали с конструкцией РНК-вакцины.Единственным испытанным условием, которое вызывало индукцию SEAP под промотором IFN-β, слитым с сайтами связывания NF-κB и AP-1, было то, что F2-РНК инкубировали с клетками HEK293-TLR7, обработанными липофектамином ™ (рис. 1 и данные не показаны). Эти данные показывают, что РНК F2 может взаимодействовать с TLR7 внутри клетки, чтобы инициировать транскрипцию генов, регулируемых NF-κB.

Рисунок 1 . Репликоны F2-РНК задействуют внутриклеточный TLR7. В (A) показаны схематические изображения репликонов F2-РНК и F3 + -РНК.В (B) клетки HEK293-Blue и HEK293-Blue, экспрессирующие TLR7 человека, инкубировали с имхимодом (IMQ), липофектамином или липофектамином и двумя разными прогонами продуцирования конструкции вакцины РНК F2 (rep1 и rep2). Экспрессию SEAP, индуцированную активацией, измеряли при OD650 нм. Данные были получены для каждого условия в трех повторностях и показаны в виде среднего и SE-кратного изменения для лунок, содержащих только среду.

Ранняя иммунная активация после инокуляции F2-РНК

Ранее мы продемонстрировали, что у мышей, получавших агонист TLR4 в стабильной эмульсии (SE), наблюдались поддающиеся измерению изменения в дренируемых лимфатических узлах, включая повышенную регуляцию маркеров ранней активации (31).Инъекция F2-РНК в икроножную мышцу аналогичным образом вызвала дозозависимое увеличение дренирующего лимфатического узла и измеримое увеличение числа клеток DLN через 24 и 48 часов после инъекции (фигура 2A и данные не показаны). Проточная цитометрия выявила повышающую регуляцию костимулирующей молекулы CD80 на CD11c ⁺ DC, а также инверсию отношения Т-клеток к В-клеткам в узле через 48 часов после инъекции (рисунки 2B, C). Большая часть B-клеток в DLN мышей, иммунизированных F2-РНК, экспрессировала CD69, хотя и на более низких уровнях, чем мыши, обработанные SLA-SE (фигура 2D).Как доля В-клеток, экспрессирующих CD69, так и уровень CD69 были максимальными через 24 часа после инъекции и со временем уменьшались (рисунки 2D, E). Таким образом, F2-РНК способна активировать врожденные иммунные ответы in vivo , создавая среду, способную индуцировать антиген-специфические Т-клеточные ответы.

Рисунок 2 . Быстрая местная иммунная активация после инокуляции РНК-F2. Мышам C57BL / 6 вводили 20 мкл вакцины в икроножную мышцу. РНК-вакцина была приготовлена ​​таким образом, чтобы обеспечить общую дозу 10 мкг.SLA-SE вводили в дозе 5 мкг на инъекцию, чтобы служить положительным контролем иммунной активации. В разное время после инъекции дренирующий лимфатический узел вырезали, готовили суспензии единичных клеток и подсчитывали (A) . Клетки инкубировали с флуоресцентно мечеными антителами, затем подвергали проточной цитометрии для определения состояния активации (B) (экспрессия CD80) на клетках, экспрессирующих CD11c; (C) отношение Т-клеток (CD3) к В-клеткам (CD19); (D, E) Состояние активации (экспрессия CD69) на В-клетках, экспрессирующих CD19.Каждая точка отображает данные из одной выборки ( n = 5 на группу), в то время как горизонтальные и вертикальные полосы показывают среднее значение и SEM, соответственно. Данные представляют результаты, полученные в 2–3 независимых экспериментах. ns = не значимо, и * и ** = p -значение <0,05 и <0,01, соответственно, при сравнении указанной группы с контрольной группой, которой вводили физиологический раствор.

Для оценки важности находки in vitro , указывающей на вовлечение TLR7, мы вводили физиологический раствор или F2-РНК мышам дикого типа и TLR7 — / -, а затем сравнивали последующие количества клеток DLN.Иммунизация вызвала значительное увеличение количества клеток в дренирующих лимфатических узлах от обоих генотипов мышей (рис. 3). При рассмотрении вместе с данными in vitro , полученными с нокаутированными клетками, эти данные in vivo показывают, что, хотя TLR7 участвует в ответе, он не является критическим для ранней иммунной активации вакциной F2-РНК.

Рисунок 3 . Активация местного иммунитета после инокуляции РНК-F2 критически не зависит от TLR7.Мышам дикого типа и TLR7 — / — C57BL / 6 вводили 20 мкл вакцины в икроножную мышцу. РНК-вакцина была приготовлена ​​таким образом, чтобы обеспечить общую дозу 10 мкг. Через 24 часа после инъекции дренирующий лимфатический узел вырезали, готовили и подсчитывали суспензии отдельных клеток. Каждая точка отображает данные по одному животному, в то время как горизонтальные и вертикальные полосы показывают среднее значение и SEM, соответственно. Данные представляют результаты, полученные в 2-3 независимых экспериментах. нс, не значимо и ** p -значение <0.01, соответственно, при сравнении указанной группы с соответствующей контрольной группой, которой вводили физиологический раствор.

Гетерологичные схемы иммунизации Prime-Boost генерируют сильную антиген-специфичную секрецию IFNγ

Для сравнения способности F2-РНК и субъединичных вакцин вызывать иммунные ответы оценивали продукцию как антиген-специфических антител, так и цитокинов. Гомологичный прайм-буст с F2 + SLA-SE вызывал чрезвычайно высокий антиген-специфический ответ IgG (фиг. 4A). Это контрастировало с реакцией антител в сыворотке мышей, иммунизированных F2-РНК, которая обнаруживалась только при очень низких титрах (рис. 4А).Когда мышам вводили обе вакцины в схемах гетерологичного праймирования / повторной вакцинации, были обнаружены промежуточные уровни антиген-специфических антител на уровнях, которые, по существу, можно отнести к одной инокуляции F2 + SLA-SE (фигура 4A и данные не показаны). Точно так же однократная иммунизация смесью F2-РНК / F2 + SLA-SE вызывала ответы, эквивалентные только иммунизации F2 + SLA-SE.

Рисунок 4 . Дихотомическая генерация гуморального и клеточного иммунитета субъединичными и РНК-вакцинами.Мышей C57BL / 6 иммунизировали указанным гомологичным или гетерологичным режимом вакцинации. Через четыре недели после иммунизации собирали кровь и готовили сыворотку, удаляли селезенки и готовили суспензии единичных клеток. В (A) величину антиген-специфического ответа F2 IgG определяли разбавлением каждого образца сыворотки в ELISA до получения отрицательных результатов. Каждая точка отображает данные из одной выборки ( n = 5 на группу), в то время как горизонтальные и вертикальные полосы показывают среднее значение и SEM, соответственно.Данные представляют результаты, полученные в 3 независимых экспериментах. Клетки селезенки инкубировали с белком F2, затем с помощью ELISA определяли концентрации (B), IFNγ или (C), IL-5 в супернатантах культур. Клетки также подвергали проточной цитометрии для определения относительной доли CD4 Т-клеток, одновременно продуцирующих (D), IFNγ и TNF или (E), IL-2 и CD154. Данные представлены в виде среднего значения и SEM, n = 3–5 на группу и являются репрезентативными для результатов, полученных в 3 независимых экспериментах.ns = не значимо, и * и ** = p -значение <0,05 и <0,01, соответственно, при сравнении указанной группы с контрольной группой, которой вводили физиологический раствор.

Хотя большое количество IFNγ секретировалось клетками мышей, получивших гомологичную иммунизацию F2 + SLA-SE, это все еще было ниже, чем чрезвычайно высокие количества IFNγ, секретируемые клетками мышей, примированных F2-РНК, а затем повторно усиленных F2. + SLA-SE (Рисунок 4B). Измерение цитокинов, секретируемых клетками, инкубированными с белком F2, обычно указывает на преимущественную секрецию IFNγ по сравнению с IL-5 (Фигуры 4B, C).Взятые вместе, эти данные показывают, что, хотя режим праймирования F2-РНК, бустинг F2 + SLA-SE не изменял ответы антител, он действительно размножал мощные антигенспецифические Т-клетки CD4.

Антиген-специфическая секреция IFNγ происходит как из CD4, так и из CD8 Т-клеток

Для непосредственной оценки антиген-специфических Т-клеточных ответов, CD44 ^hi Т-клетки памяти CD4 были идентифицированы среди клеток селезенки после инкубации с антигеном F2. Активированные антиген-специфические клетки, на что указывает экспрессия CD154 (CD40L) и продукция IL-2, были индуцированы всеми режимами иммунизации (фигура 4E; все p -значение <0.05 по сравнению с физиологическим раствором). Гомологичный прайм-буст с F2 + SLA-SE генерировал более устойчивый ответ памяти Т-лимфоцитов CD4, чем гомологичный прайм-буст с F2-РНК, о чем свидетельствует большая доля клеток или продуцирующих IFNγ и TNF, или продуцирующих IL-2 и экспрессирующих CD154 ( Рисунки 4D, E). Стратегия гетерологичного прайм-бустинга, включающая прайминг с помощью F2-РНК с последующей имитацией белком и SLA-SE, генерировала значительную популяцию F2-специфичных CD4 Т-клеток, которая была намного больше, чем даже та, которая была индуцирована гомологичным прайм-бустом с F2 +. SLA-SE.Эти данные демонстрируют, что даже несмотря на то, что F2-РНК сама по себе не вызывала очень большой Т-клеточный ответ CD4, она сильно примировала клетки для стимулирования мощного Т-клеточного ответа CD4 при дальнейшей стимуляции F2 + SLA-SE.

Чтобы расширить наблюдения, сделанные с вакцинами F2, мы иммунизировали мышей вакцинами, содержащими антиген F3 + (25). Инкубация клеток селезенки от мышей, которые были иммунизированы гомологичным первичным бустом с F3 + с SLA-SE или первичной гетерологичной РНК, протеин / адъювант, продуцировали клетки, которые секретировали IFNγ при инкубации с протеином (фиг. 5A).Учитывая, что мы определили эпитопы, ограниченные MHCI, в LEISH-F3 +, эти вакцины также позволили нам оценить, могут ли генерироваться антиген-специфические CD8 Т-клетки. Клетки мышей обеспечивали вакцины на основе РНК (либо гомологичным, либо гетерологичным образом), продуцирующим IFNγ в ответ на пептиды, представляющие эпитопы, ограниченные F3 + MHCI (фиг. 5B). Это контрастировало с клетками мышей, иммунизированных F3 + конструкцией SLA-SE, у которых не было продемонстрированного ответа (фигура 5B). Таким образом, в отличие от гомологичных схем, гетерологичный прайм с конструкцией РНК F3 + с последующим усилением белком F3 + с SLA-SE генерировал как устойчивый ответ памяти Т-клеток CD4, так и ответ Т-клеток CD8.

Рисунок 5 . Дифференциальная генерация CD4- и CD8-Т-клеточных ответов субъединичными и РНК-вакцинами. Мышей C57BL / 6 иммунизировали указанным гомологичным или гетерологичным режимом вакцинации, включающей антиген или последовательность LEISH-F3 +. Через четыре недели после иммунизации селезенки удаляли и готовили суспензии единичных клеток. Клетки селезенки инкубировали с белком (A), F3 + или (B), , пулом пептидов, ограниченных MHCI, полученных из F3 +. Концентрацию IFNγ в культуральных супернатантах определяли с помощью ELISA.Данные представлены в виде среднего значения и SEM, n = 5 на группу, и являются репрезентативными для результатов, полученных в 3 независимых экспериментах. ns = несущественно и ** = p -значение <0,01, соответственно, при сравнении указанной группы с контрольной группой, которой вводили физиологический раствор. $ = p — значение <0,05 при сравнении указанной группы против F3 + с группой, иммунизированной SLA-SE.

Гетерологические схемы иммунизации Prime-Boost создают защиту от экспериментального

Продемонстрировав, что гетерологичные стратегии с использованием F2-РНК и F2 + SLA-SE вызывают сочетание антиген-специфических CD4- и CD8-Т-клеточных ответов, мы оценили, могут ли эти ответы защитить от инфекции L. donovani . Гомологичная (всего две) иммунизация либо F2 + SLA-SE, либо F2-РНК не приводила к значительному снижению количества паразитов в печени у мышей, инфицированных L. donovani (фиг. 6). Однако количество паразитов было значительно снижено у мышей, которые были иммунизированы режимом буст-бустинга гетерологичной F2-РНК / F2 + SLA-SE (фиг.6, p -value = 0.015). Таким образом, укороченные схемы иммунизации, которые включали РНК-вакцину, вызывали ответы, которые были достаточно мощными для защиты от инфекции внутриклеточным паразитом.

Рисунок 6 . Защита от инфекции L. donovani с помощью схемы гетерологичной иммунизации первичной буст-иммунизации. Мышей C57BL / 6 иммунизировали указанным гомологичным или гетерологичным режимом введения F2-содержащих вакцин. Мышей инфицировали внутривенной инокуляцией паразитов L. donovani через 4 недели после их последней или единственной иммунизации.Через четыре недели после заражения удаляли печень и определяли количество паразитов для каждого животного с помощью ПЦР. Данные представлены в виде среднего значения и SEM, n = 7 на группу. * = p — значение <0,05 при сравнении указанной группы с контрольной группой, которой вводили физиологический раствор.

Обсуждение

Перед лицом новых инфекционных заболеваний и патогенов, устойчивых к лекарствам, обычно предпочтительны вакцины, которые могут быстро вызывать защитные реакции. Очень важно разработать быстрые и масштабные процедуры производства таких вакцин.В качестве доказательства концепции быстрого создания вакцины, обеспечивающей защиту через Т-клетки, мы создали РНК F2 с целью защиты от инфекции L. donovani . Встраивание гена F2 в репликон альфавируса создало РНК F2, которая индуцировала врожденные ответы посредством вовлечения внутриклеточного TLR7 и способствовала локальным иммунным ответам с активацией APC. В то время как иммунизация только РНК F2 вызвала только небольшую популяцию антиген-специфических клеток Th2, схема гетерологической иммунизации, включающая праймирование РНК F2 с последующей бустинг-вакциной LEISH-F2 + SLA-SE (рекомбинантный антиген / синтетический адъювант), привела к чрезвычайно высокому результату. мощные ответы Th2 и секреция IFNγ.

С момента их первоначального зачатия, имитируя иммунизацию живой вакциной, вакцины на основе нуклеиновых кислот, доставляемые вирусным путем, например, с вирусными частицами репликона или аналогичными системами, обещали быть эффективным способом индукции Т-клеточного иммунитета. В частности, вирусная доставка РНК репликона, происходящей из рода альфавирусов, продемонстрировала мощные Т-клеточные ответы CD8 (32). Однако зависимость от вирусных белков, опосредующих доставку нуклеиновых кислот, индуцирует противовекторный иммунитет, что исключает повторное использование платформы по другим показаниям (33).Чтобы обойти эту проблему, мы сосредоточились на иммунизации репликоном голой РНК, полученным из вакцинного штамма альфавируса вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEEV), TC-83, который имеет долгую историю доклинических и, в последнее время, клинических разработок. (32, 34, 35).

Клинические испытания продемонстрировали безопасность и переносимость вакцин на основе нуклеиновых кислот (36, 37). Относительная простота конструирования и производства вакцин на основе нуклеиновых кислот предполагает, что их можно производить недорого и в некоторой степени универсальным способом.Хотя мы не разработали РНК-вакцину против мишени de novo , основываясь на субъединичной вакцине с уже определенной мишенью, мы смогли использовать РНК-вакцину, производящую ту же мишень, для усиления иммунных ответов и снижения потребности в более чем две прививки. Связывание РНК и субъединичных вакцин в схеме гетерологичной первичной бустерной вакцинации вызывало чрезвычайно сильные ответы Т-лимфоцитов CD4, которые устраняли необходимость в множественной иммунизации субъединичной вакциной. Таким образом, наши данные предполагают, что в условиях, когда доступные количества определенной вакцины могут быть ограничены (т.е., пандемические вспышки), быстрое создание РНК-вакцины, кодирующей тот же антиген-мишень, можно было бы быстро создать как средство восполнения дефицита предложения.

Интересно, что наши данные показывают, что иммунизация только РНК F2 вызывала иммунные ответы, качественно отличающиеся от субъединичной вакцины LEISH F2. Иммунизация субъединичной вакциной вызвала несколько более сильные ответы Th2 и гораздо более сильные ответы антител, чем иммунизация только РНК F2, которая вызвала низкие ответы Th2 и только очень слабые ответы антител.Эти данные указывают на важное влияние платформы продукции / презентации антигена на иммунитет и предполагают, что иммунизация «голой» РНК может использоваться для преимущественной индукции Т-клеточных ответов. Действительно, эксперименты с вакциной F3 + РНК позволили нам различить преимущественную индукцию антиген-специфичных ответов Т-лимфоцитов CD8. Необходимы долгосрочные эксперименты по иммунизации, чтобы определить, как долго сохраняются эти CD4- и CD8-Т-клеточные ответы. Сведение к минимуму образования антител может быть полезным в клинических или терапевтических ситуациях, когда иммунные комплексы могут вызывать осложнения.

Наши данные демонстрируют, что, хотя и РНК, и субъединичные вакцины вызывали ранние изменения клеточного состава и состояния активации дренирующего лимфатического узла, были некоторые отличительные особенности. Хотя F2 + SLA-SE индуцировал у большинства клеток CD11c ⁺ повышенную регуляцию клеток CD80 и CD19 ⁺ для экспрессии высоких уровней CD69, эти изменения были индуцированы на более низких уровнях вследствие инъекции РНК F2. Напротив, РНК F2 вызывала более выраженное регулирование соотношения Т-клетки: В-клетки в дренирующем лимфатическом узле, чем F2 + SLA-SE.В настоящее время мы можем только предполагать, что эти ранние различия способствуют дихотомическим антиген-специфическим Т-клеточным ответам, вызываемым каждой вакциной. Представляется целесообразным дальнейшая оценка этих ранних событий и профилей цитокинов в дренирующем лимфатическом узле. Точно так же относительный вклад CD4 или CD8 Т-клеток в защиту от инфекции Leishmania можно определить путем дальнейших иммунных сравнений или использования мышей с дефицитом гена.

На сегодняшний день ограничительной особенностью вакцин с голой РНК является их неутешительная эффективность, что указывает на необходимость усилий по повышению иммуногенности.Как и в других отчетах, посвященных изучению мРНК, наши данные показывают, что репликон РНК F2 задействует TLR7 для активации врожденных иммунных ответов (38, 39). Эта активация приводит к изменениям клеточного состава в локальном лимфатическом узле. Хорошо задокументировано, что передача сигналов TLR7 совместима с широким спектром врожденных рецепторов для усиления ответов, что предполагает возможность включения дополнительных агонистов для обеспечения аддитивного или синергетического воздействия на ответы Т-клеток (40). Это будет действовать аналогично повышению эффективности мРНК вакцины путем введения лиганда Flt3 или РНК, кодирующей GM-CSF (41, 42).Следует также отметить, что в нашем исследовании использовался репликон «голой» РНК (т. Е. Составленный только в физиологическом разбавителе), и в настоящее время проводится большое количество исследований по составлению РНК, чтобы защитить ее от разрушающих ферментов, а также для обеспечения ее доставки. через клеточную мембрану. Работа была сосредоточена на инкапсуляции в липосомы и комплексообразовании с катионными полимерами, чтобы защитить их от деградации и повысить клеточное поглощение (43, 44).

В совокупности наши результаты демонстрируют быстрое производство РНК-вакцины и дополнительно указывают на полезность РНК-вакцин для стимулирования Т-клеточных ответов CD4.Этот процесс разработки имеет большое значение для быстрого предоставления вакцин, которые могут защитить от вновь появляющихся патогенов, для которых отсутствуют четкие стратегии лечения или контроля.

Авторские взносы

MD, NH, JE, DS и SR разработали эксперименты и внесли свой вклад в написание рукописей. ZM, RM, JE сконструировали репликоны РНК. ZM, AP, MD и F-CH проводили эксперименты по иммунизации и иммуноанализу. MD, NH, JE и F-CH провели анализ данных.

Финансирование

Эта работа финансировалась Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний Национальных институтов здравоохранения под номером R01AI025038 и Фондом Билла и Мелинды Гейтс в рамках гранта № 631 при дополнительной поддержке контракта NIH № HHSN272201600036C.Авторы несут полную ответственность за содержание, которое не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института здравоохранения или Фонда Билла и Мелинды Гейтс.

Заявление о конфликте интересов

Стивен Рид и Малкольм Дути являются соавторами патента на разработку вакцины против лейшманиоза. Все остальные авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Эта рукопись не была бы завершена без значительного вклада и вклада доктора Др.Дэн Стинчкомб перед смертью 21 февраля 2018 г.

Сокращения

APC, антигенпрезентирующая клетка; ELISA, иммуноферментный анализ; GLA, глюкопиранозил липидный адъювант; ИФН, интерферон; ИЛ, интерлейкинп; РНК, рибонуклеиновая кислота; SE, стабильная эмульсия; SLA; TLR, Toll-подобный рецептор; TNF, фактор некроза опухоли; VEEV, вирус венесуэльского конского энцефалита; ВЛ, висцеральный лейшманиоз.

Список литературы

2. Парди Н., Хоган М.Дж., Пелк Р.С., Мурамацу Х., Андерсен Х., ДеМасо С.Р. и др.Защита от вируса Зика с помощью однократной вакцинации малой дозой модифицированной нуклеозидами мРНК. Nature (2017) 543: 248–51. DOI: 10.1038 / nature21428

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

3. Ричнер Дж. М., Химансу С., Дауд К. А., Батлер С. Л., Салазар В., Фокс Дж. М. и др. Вакцины с модифицированной мРНК защищают от заражения вирусом Зика. Cell (2017) 168: 1114–25 e1110. DOI: 10.1016 / j.cell.2017.02.017

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

4.Бетанкур Д., де Кейроз Н.М., Ся Т., Ан Дж., Барбер Г.Н. Передний край: вирус везикулярного стоматита, усиливающий врожденный иммунитет, экспрессирующий белки вируса Зика, обеспечивает защитный иммунитет. Дж. Иммунол . (2017) 198: 3023–28. DOI: 10.4049 / jimmunol.1602180

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

5. Хекеле А., Бертолет С., Арчер Дж., Гибсон Д.Г., Палладино Дж., Брито Л.А. и др. Быстро производимая вакцина SAM ((R)) против гриппа H7N9 является иммуногенной для мышей. Emerg Microbes Infect .(2013) 2: e52. DOI: 10.1038 / emi.2013.54

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

6. Блэквелл Дж. М., Факиола М., Ибрагим М. Е., Джеймисон С. Е., Джеронимо С. Б., Миллер Э. Н. и др. Генетика и висцеральный лейшманиоз: мышей и человека. Parasite Immunol . (2009) 31: 254–266. DOI: 10.1111 / j.1365-3024.2009.01102.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

8. Локсли Р.М., Скотт П. Подмножества Т-хелперных Т-клеток при лейшманиозе мышей: индукция, экспансия и эффекторная функция. Immunol Today (1991) 12: A58–61. DOI: 10.1016 / S0167-5699 (05) 80017-9

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

9. Скотт П. Факторы хозяина и паразитов, регулирующие развитие субпопуляций CD4 + Т-клеток при экспериментальном кожном лейшманиозе. Рес Иммунол . (1991) 142: 32–6. DOI: 10.1016 / 0923-2494 (91) ^-7

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

11. Scharton-Kersten T, Afonso LC, Wysocka M, Trinchieri G, Scott P.IL-12 необходим для активации естественных клеток-киллеров и последующего развития Т-хелперных клеток 1 при экспериментальном лейшманиозе. Дж. Иммунол . (1995) 154: 5320–30.

PubMed Аннотация | Google Scholar

12. Хатчинс А.С., Артис Д., Хендрих Б.Д., Берд А.П., Скотт П., Райнер С.Л. Передний край: критическая роль сайленсинга генов в предотвращении чрезмерного иммунитета типа 1. Дж. Иммунол . (2005) 175: 5606–10. DOI: 10.4049 / jimmunol.175.9.5606

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

15.Карвалью Е.М., Баселлар О., Браунелл К., Регис Т., Коффман Р.Л., Рид С.Г. Восстановление продукции IFN-гамма и пролиферации лимфоцитов при висцеральном лейшманиозе. Дж. Иммунол . (1994) 152: 5949–56.

PubMed Аннотация | Google Scholar

16. Верма С., Кумар Р., Катара Г.К., Сингх Л.С., Неги Н.С., Рамеш В. и др. Количественная оценка паразитарной нагрузки в клинических образцах больных лейшманиозом: уровень ИЛ-10 коррелирует с паразитарной нагрузкой при висцеральном лейшманиозе. PLoS ONE (2010) 5: e10107.DOI: 10.1371 / journal.pone.0010107

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

19. Кумар Р., Сингх Н., Гаутам С., Сингх О.П., Гидвани К., Рай М. и др. Т-лимфоциты CD4, специфичные для лейшмании, выделяют IFN-гамма, который ограничивает репликацию паразитов у пациентов с висцеральным лейшманиозом. PLoS Negl Trop Dis . (2014) 8: e3198. DOI: 10.1371 / journal.pntd.0003198

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

20. Карвалью Е.М., Бадаро Р., Рид С.Г., Джонс Т.К., Джонсон В.Д. мл.Отсутствие продукции гамма-интерферона и интерлейкина 2 при активном висцеральном лейшманиозе. Дж. Клин Инвест . (1985) 76: 2066–9.

PubMed Аннотация | Google Scholar

21. Kaushal H, Bras-Goncalves R, Negi NS, Lemesre JL, Papierok G, Salotra P. Роль CD8 (+) T-клеток в защите от инфекции Leishmania donovani у излеченных лиц с висцеральным лейшманиозом. BMC Infect Dis . (2014) 14: 653. DOI: 10.1186 / s12879-014-0653-6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

23.Шер А., Газзинелли Р. Т., Освальд И. П., Клеричи М., Куллберг М., Пирс Э. Дж. И др. Роль цитокинов, полученных из Т-клеток, в подавлении иммунных ответов при паразитарных и ретровирусных инфекциях. Immunol Rev. (1992) 127: 183–204. DOI: 10.1111 / j.1600-065X.1992.tb01414.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

24. Бертолет С., Гото Ю., Картер Л., Бхатиа А., Ховард Р.Ф., Картер Д. и др. Оптимизированная субъединичная вакцина защищает от экспериментального лейшманиоза. Vaccine (2009) 27: 7036–45. DOI: 10.1016 / j.vaccine.2009.09.066

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

25. Колер Р.Н., Дати М.С., Хофмайер К.А., Гудериан Дж., Джаяшанкар Л., Вергара Дж. И др. От мыши к человеку: безопасность, иммуногенность и эффективность кандидатной вакцины против лейшманиоза LEISH-F3 + GLA-SE. Clin Transl Immunol. (2015) 4: e35. DOI: 10.1038 / cti.2015.6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

26.Дати М.С., Перейра Л., Фавила М., Хофмейер К.А., Рид С.Дж., Метангмо С. и др. Вакцина с определенной субъединицей, которая защищает от трансмиссивного висцерального лейшманиоза. Вакцины NPJ (2017) 2:23. DOI: 10.1038 / s41541-017-0025-5

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

27. Эразмус Дж., Кхандхар А., Гудериан Дж., Грейнджер Б., Арчер Дж., Арчер М. и др. Наноструктурированный липидный носитель для доставки реплицирующейся вирусной РНК обеспечивает однократную защиту от вируса Зика в малых дозах. Mol Ther. (2018) 26: 1–16. DOI: 10.1016 / j.ymthe.2018.07.010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

28. Дути М.С., Гото В., Иретон Г.С., Рис С.Т., Кардосо Л.П., Мартелли С.М. и др. Использование белковых антигенов для ранней серологической диагностики лепры. Clin Vaccine Immunol. (2007) 14: 1400–8. DOI: 10.1128 / CVI.00299-07

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

29. Duthie MS, Goto W., Ireton GC, Reece ST, Sampaio LH, Grassi AB, et al.Антиген-специфические Т-клеточные ответы больных лепрой. Clin Vaccine Immunol. (2008) 15: 1659–65. DOI: 10.1128 / CVI.00234-08

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

30. Картер Д., Фокс С. Б., Дэй Т. А., Гудериан Дж. А., Лян Х., Рольф Т. и др. Структурно-функциональный подход к оптимизации лигандов TLR4 для вакцин для человека. Клин Транс Иммунол . (2016) 5: e108. DOI: 10.1038 / cti.2016.63

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

31.Desbien AL, Reed SJ, Bailor HR, Dubois Cauwelaert N, Laurance JD, Orr MT, et al. Эмульсия сквалена усиливает адъювантную активность агониста TLR4, GLA, через воспалительные каспазы, IL-18 и IFN-гамма. Eur J Immunol. (2015) 45: 407–17. DOI: 10.1002 / eji.201444543

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

34. Strauss JH, Strauss EG. Альфавирусы: экспрессия, репликация и эволюция генов. Microbiol Rev. (1994) 58: 491–562.

PubMed Аннотация | Google Scholar

35. Аташева С., Ким Д. Ю., Ахрымук М., Морган Д. Г., Фролова Е. И., Фролов И. Вирус псевдоинфекционного венесуэльского энцефалита лошадей: новое средство ослабления альфавирусов. J Virol. (2013) 87: 2023–35. DOI: 10.1128 / JVI.02881-12

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

36. Ферраро Б., Морроу М.П., ​​Хатник Н.А., Шин Т.Х., Лакке С.Е., Вайнер Д.Б. Клиническое применение ДНК-вакцин: текущий прогресс. Clin Infect Dis . (2011) 53: 296–302. DOI: 10.1093 / cid / cir334

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

37. Alberer M, Gnad-Vogt U, Hong HS, Mehr KT, Backert L, Finak G, et al. Безопасность и иммуногенность мРНК вакцины против бешенства у здоровых взрослых: открытое, нерандомизированное, проспективное, первое клиническое испытание фазы 1 с участием людей. Ланцет (2017). DOI: 10.1016 / S0140-6736 (17) 31665-3

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

38.Fotin-Mleczek M, Duchardt KM, Lorenz C, Pfeiffer R, Ojkic-Zrna S, Probst J, et al. Вакцины на основе матричной РНК с двойной активностью вызывают сбалансированные TLR-7-зависимые адаптивные иммунные ответы и обеспечивают противоопухолевую активность. Дж. Иммунодер . (2011) 34: 1–15. DOI: 10.1097 / CJI.0b013e3181f7dbe8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

39. Шил Б., Тойфель Р., Пробст Дж., Карралот Дж. П., Гегинат Дж., Радсак М. и др. Зависимая от толл-подобных рецепторов активация нескольких типов клеток крови человека с помощью протамин-конденсированной мРНК. Eur J Immunol . (2005) 35: 1557–66. DOI: 10.1002 / eji.200425656

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

40. Fox CB, Sivananthan SJ, Duthie MS, Vergara J, Guderian JA, Moon E, et al. Система доставки нанолипосом для синергического запуска TLR4 И TLR7. Дж. Нанобиотехнология . (2014) 12:17. DOI: 10.1186 / 1477-3155-12-17

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

41. Крейтер С., Дикен М., Селми А., Петченка Дж., Туречи О., Сахин У.Лиганд FLT3 как молекулярный адъювант для вакцин с «голой» РНК. Методы Мол Биол . (2016) 1428: 163–75. DOI: 10.1007 / 978-1-4939-3625-0_11

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

42. Hess PR, Boczkowski D, Nair SK, Snyder D, Gilboa E. Вакцинация мРНК, кодирующей ассоциированные с опухолью антигены и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, эффективно запускает CTL-ответы, но недостаточна для преодоления толерантности к модельной опухоли / собственный антиген. Cancer Immunol Immunother. (2006) 55: 672–83. DOI: 10.1007 / s00262-005-0064-z

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

43. Гелл А.Дж., Верма А., Оттен Г.Р., Шоу Калифорния, Хекеле А., Банерджи К. и др. Невирусная доставка самоусиливающихся РНК-вакцин. Proc Natl Acad Sci USA. (2012) 109: 14604–9. DOI: 10.1073 / pnas.1209367109

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

44. Брито Л.А., Чан М., Шоу КА, Хекеле А., Карсилло Т., Шефер М. и др.Катионная наноэмульсия для доставки РНК-вакцин нового поколения. Mol Ther. (2014) 22: 2118–29. DOI: 10.1038 / mt.2014.133

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

% PDF-1.3 % 14163 0 объект > эндобдж xref 14163 49 0000000016 00000 н. 0000001359 00000 н. 0000001728 00000 н. 0000001882 00000 н. 0000009114 00000 п. 0000009612 00000 н. 0000010383 00000 п. 0000010617 00000 п. 0000011180 00000 п. 0000011613 00000 п. 0000011831 00000 п. 0000012063 00000 п. 0000012095 00000 п. 0000012140 00000 п. 0000012164 00000 п. 0000012690 00000 п. 0000012714 00000 п. 0000013079 00000 п. 0000013103 00000 п. 0000013346 00000 п..|, x-1RF] # nЂ $ KG — zb (Oa) Rѩl} u # L Ⱦq // xt] 0inDgn = Cy / ‘r_NźuF ߘ §4 ~ ivd͔d «piYaźD ~ Rsg4d $ zj ~ ̇7 ‘} y.jSmql9RQY T% T + 6r \ U | R

Трехмерная биопечать имплантатов с преваскуляризацией для восстановления костных дефектов критического размера

Abstract

Для масштабирования трехмерных биопечати тканей до клинически значимых размеров необходимы эффективные стратегии преваскуляризации. обеспечивают необходимые питательные вещества для нормального обмена веществ и удаления побочных продуктов жизнедеятельности. Целью этого исследования было разработать стратегию биопечати для создания преваскуляризированных тканей in vitro и изучить способность таких конструкций усиливать васкуляризацию и регенерацию крупных костных дефектов in vivo .На основе анализа различных биочувствительных элементов было обнаружено, что гидрогель на основе фибрина лучше всего поддерживает прорастание эндотелиальных клеток пупочной вены (HUVEC) и создание сети микрососудов. Когда этот биочувствительный элемент был объединен с HUVECs и поддерживающими стволовыми / стромальными клетками костного мозга человека (hBMSCs), эти сети микрососудов сохранялись in vitro . Кроме того, только ткани с биопринтом, содержащие как HUVEC, так и hBMSC, которым впервые позволили созреть in vitro , поддерживали устойчивое развитие кровеносных сосудов in vivo .Чтобы оценить терапевтическую ценность этой стратегии биопечати, эти биочернила были использованы для преваскуляризации 3D-печатных каркасов из поликапролактона (PCL), которые впоследствии были имплантированы в дефекты бедренной кости критического размера у крыс. Микрокомпьютерная томография (µCT) ангиография выявила повышенные уровни васкуляризации in vivo , что коррелировало с более высокими уровнями образования новой кости. Такие преваскуляризированные конструкции могут быть использованы для усиления васкуляризации ряда крупных тканевых дефектов, что составляет основу множества новых терапевтических средств с биопринтом.