Запчасти для электро и бензо инструмента в Ростове-на-Дону
Skip to contentтел 8 939 789 12 13
тел 8 951 539 26 98
тел 8 928 159 34 13
тел 8 900 123 28 33
ОТЕЧЕСТВЕННЫЕ И ИМПОРТНЫЕ ЗАПЧАСТИ НА БЕНЗО И ЭЛЕКТРОИНСТРУМЕНТ
Наша компания занимается розничными и оптовыми поставками запчастей к электро и бензоинструменту, бытовой технике отечественного и импортного производства
запчасти на
ЭЛЕКТРОИНСТРУМЕНТ
запчасти на
БЕНЗОИНСТРУМЕНТ
запчасти на
БЫТОВУЮ ТЕХНИКУ
инструменты и
РАСХОДНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
ИНТЕРНЕТ-МАГАЗИН ЗАПЧАСТЕЙ ДЛЯ ЭЛЕКТРОИНСТРУМЕНТА И БЕНЗОИНСТРУМЕНТА
Наша REMBAZARND — предоставляет профессиональный ремонт электроинструмента и бензоинструмента, садовой и бытовой техники, электроники. Вы можете обратиться к нам с различного рода инструмента, и наши опытные сотрудники произведут ремонт как: бензопил, бензокос, мотоблоков, газонокосилок, триммеров, мотокультиваторов, мотоблоков и другой садовой техники.
РЕМОНТ Expand
Вам необходимо отремонтировать нерабочий инструмент или перемотать сгоревший якорь или статор, вы можете обратиться в наши сервисные центры:
СЦ «Гайка» г. Ростов-на-Дону ул. Ульяновская, д. 30 тел. +7 (951) 821-12-60, +7 (863) 285-68-63, бесплатный по России 8 (800) 200-71-35, mail: [email protected]
Ремонт, аренда, продажа бензоинструмента, электроинструмента, генераторов, компрессоров:
СЦ ИП Горбаненко г. Ростов-на-Дону ул. Студенческая, д. 11, тел. +7 (918) 532-28-25, +7 (929) 818-96-94, mail: [email protected]
УСЛОВИЯ ОФЕРТЫ Expand
Просим обратить ваше внимание на то, что интернет-сайт «запчасти-бензо-электро-инструмент.рф» носит исключительно информационный характер, ни при каких условиях не является публичной офертой, определяемой положениями Ст. 437 п.2 ГК РФ. Для получения подробной информации о технических характеристиках, наличию и стоимости товаров, просим обратиться к администрации сайта при помощи формы обратной связи или по телефонам: +7 928 159 34 13, +7 951 539 26 98, +7 900 123 28 33
Присланное на e-mail сообщение, содержащее копию оформленной формы заявки на сайте, не является ответом на сообщение потребителя или подтверждением заказа со стороны владельцев сайта.
ПРЕИМУЩЕСТВА Expand
Запчасти для бензоинструмента и электроинструмента выгодно купить в
REMBAZARND потому что:- Большой ассортимент деталей Более 200 000 деталей;
- Быстрая доставка. У нас так же организованны услуги доставки различными способами это почтой, курьерской доставкой и транспортной компанией, а так же есть самовывоз;
- Оплата. Что касается оплатой то это можно осуществить любым удобным для вас способом, наличный расчет при получении, онлайн.;
- Отправление деталей в день заказа.
ОПТОВИКАМ Expand
Рады предложить особые условия для сервисных центров и оптовых покупателей. Для постоянных клиентов действует накопительная система скидок.
БЕЗОПАСНОСТЬ
Наши специалисты всегда помогут подобрать запчасть
НАДЕЖНОСТЬ
Гарантия от производителя
КАЧЕСТВО
Наша продукция всегда имеет высокое качество
Ищите, где купить запчасти для электро и бензо инструмента в Ростове-на-Дону? Наш интернет магазин (РембазаРНД) специально создан для этого. У нас обширный ассортимент деталей практически на любые марки и модели инструмента, по крайней мере на все самые популярные модели. Наш каталог понятен и доступен в пользовании, а если вдруг вы не можете самостоятельно найти необходимую вам деталь, то наши менеджеры с радостью вам помогут. Вам нужно лишь оставить заявку у нас на сайте или связаться с консультантами по телефону.
Наш сайт создан не только для сервисных центров и мастерских по ремонту электроинструмента, но и частных лиц. Вам не нужно, для того чтобы осуществить покупку пройти сложную регистрацию, просто добавьте нужный вам товар в корзину и заполните короткую анкету из нескольких пунктов. Наша служба доставки привезет нужные вам детали по вашему адресу. Так же вы всегда сможете забрать купленный вами товар у нас в магазине. Территориально мы располагаемся на территории рынка «Атлант» в Ростове-на-Дону. Мы разделили каталог интернет магазина на категории, в которых расположены списки товаров, в каждом из товаров имеется понятное описание и характеристики. В каталоге находятся как сами запчасти для ремонта электроинструмента и бензоинструмента, так и ремкомплекты для восстановления работы детали. Наш интернет магазин удобен тем что он работает круглосуточно и без выходных в отличие от физических магазинов на данную тематику. Мы не просто продаем детали и запчасти для инструмента, а самостоятельно разбираемся в поломках и моделях инструмента. Наши консультации будут максимально компетентными, благодаря нам многие сэкономили немало средств и времени на покупке различных товаров. С нами удобно и выгодно, осталось лишь позвонить нам.
Наша компания предлагает довольно выгодные цены на огромный ассортимент запчастей для электроинструмента и бензоинструмента в Ростове-на-Дону. Вы можете самостоятельно подобрать нужную вам деталь прогулявшись по каталогу нашего интернет магазина или воспользоваться консультацией опытного специалиста нашей компании. Мы компетентны не только в вопросах цены и наличия тех или иных товаров, но и в вопросах поломок.
Очень многие обратившиеся к нам люди получили консультации по подбору нужной детали из списка предполагаемых и сэкономили не мало средств и времени.г Ростов-на-Дону
ул. Орская, д. 17 Г
пн 6 -16 вт- ср 9 -16
чт 8 -16 пт-вс 9 -16
тел 8 928 159 34 13
тел 8 951 539 26 98
тел 8 900 123 28 33
Электро/бензо-инструмент в Павлово и доставка по городу!
- Электро/бензо-инструмент
Бытовая техника
Видеонаблюдение
ГКЛ,ГВЛ
Двери
Игрушки
— ВЕЛОСИПЕДЫ,САМОКАТЫ И ЭЛЕКТРОМОБИЛИ — ГИГИЕНА/ДЕТСКИЕ ТОВАРЫ — ДЕРЕВЯННЫЕ ИГРУШКИ,КУБИКИ — ДЕТСКАЯ МЕБЕЛЬ И ПОСУДА — ДЕТСКИЕ КНИГИ,РАСКРАСКИ — ДЕТСКИЙ ТРАНСПОРТ — ДЕТСКОЕ ОРУЖИЕ — ИГРУШКИ — ИГРУШКИ В НАБОРАХ — ИГРУШКИ ДЛЯ МАЛЫШЕЙ — ИГРУШКИ МУЗЫКАЛЬНЫЕ — ИГРУШКИ НА БАТАРЕЙКАХ — интек2 — КАНЦТОВАРЫ И ШКОЛЬНЫЕ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ — КОНСТРУКТОРЫ, СТРОИТЕЛЬНЫЕ НАБОРЫ — КУКЛЫ,ПУПСЫ И АКСЕССУАРЫ — маркер — маркер 2 — МЯГКАЯ ИГРУШКА — НАБОРЫ ДЛЯ ТВОРЧЕСТВА — НАДУВКА — НАСТОЛЬНЫЕ ИГРЫ — Неигрушки — ПРАЗДНИК И ДЕНЬ РОЖДЕНИЯ — РАДИОУПРАВЛЯЕМЫЕ ИГРУШКИ — РАЗВИТИЕ И ОБУЧЕНИЕ — РЕЗИНОВЫЕ ИГРУШКИ, ЛИЗУНЫ, ПУЗЫРИ — СПОРТ И ИГРЫ НА УЛИЦЕ — СУМКИ — УКРАШЕНИЯ,КОСМЕТИКА,КОСТЮМЫ
Инструменты
— Болторезы,брусок — Бумага, сетка шлифовальная — Валики — Ванночки для краски — Ведра/Тазы/вантуз — Веревки/Шпагат — Гвоздодер — Горелки, резаки/паяльная лампа — Грабли/Вилы — Державка для кол. пил/керно — Заклепочник/зажим/просекатель/газобетон — Инструмент OMBRA — Каски — Кельма/Мастерок/Гладилка — Кисти — Клей — Клупп — Ключи — Комплектующие для лобзика/набор полотен для лобзика/пилка — Крестики для плитки/набор для укл.ламината — КРУГИ ОТРЕЗНЫЕ — Крюк для вязки арматуры — Лом, Бур садовый, Ледорубы — Лопаты/черенки — Маркер/Карандаши — Миксер/Насадки — Молотки/Кувалды/Киянка — Набор для врезки дв.зам. — Наборы инструм/головок торц. /шестигранников/КRAFT — Наколенники/наушники — Напильник — Ножи/мачете/рубанки — Ножницы по металлу, пластику — Ножовки/полотно ножовч/пила — Обивка — Отвертки/наборы отверток — Отвес строительный — Очки — Пакеты, ящики,мешки — Перчатки/рукавицы — Пистолеты/стержни — Плиткорезы — Правило/плоскогубцы,кусачки.бокорезы/клещи — Расшивка — Ремни,лазы,когти — Респираторы — Рулетки — Сверла/ Буры /Плашки/Биты/Коронки — Секатор/лампа паяльная/баллон — Серпянка/демферная лента/Фибра — Скотч /Ленты/Уплотнитель — Стамески/наборы стамесок — Стеклодомкрат — Стеклорезы — Стеллажи — Степлер — Стусло/Струбцина/Тиски — Стяжки/Стропа грузовая — Тачки садовые, строительные — Терки/оправка/Полутерки — Топоры/тросс сантех.
Кирпич,блоки.брусчатка,камень
Компьютерная периферия
Крепеж
— Анкера — Блоки строительные — Болты, гайки, шайбы,шуруп — Гвозди — Гибкая связь/аналог «Гален-анкер» — Для пластик.окон — Дюбель — Заглушка для труб — Заглушки — Зажимы — Заклепки вытяжные комб. алюм.-сталь — Карабины — Крепление для вагонки(кляймер) — Крепления для маяков — Крюк — Крюки настенные — Опорные колеса — Перфорированный крепеж — Под старину — Проволока стальн. низкоуглер.т/о МФ ГОСТ 3282-74 — Саморезы — Система крепежа забора — Скобы строительные/такелажные — Талреп — Трос, цепь, веревки — Фиксаторы д/арматуры — Шпилька резьбовая/сантехническая/сантехн.
болтКровля,фасад
Лаки-краски
Люки/Поверхностный водоотвод
Мебель
— Аксессуары — БравоМебель — Е1 Шкафы-купе — Камины — Кресла, кресла-качалки, столы журнальные М. — Кромка — Кухни Виват — Матрасы ДримЛайн — Мебель PDM — Мебель Арника — Мебель Виват — Мебель из ротанга — Мебель Моби — Мебель Тетчер — Мягкая мебель — Мягкая мебель Виза — Направляющие.петли, газ-лифты — Ножки мебельные — Офисные кресла, стулья — Плинтуса д/столешниц — Посудосушители — Рейлинг — Ручки д/фасадов — Столешницы, щиты — Столы, стулья — Фурнитура — Фурнитура ГРЕЙС — Шкафы/жур.столики/вешалки/обувницы
Металлопрокат СТ3, сетка кладочная
Напольные покрытия
Отделочные материалы
Пиломатериал
Плитка керамическая
Сантехника
— Аксессуары для ванной — Антифриз ( теплоноситель ) — Ванны — Вентиляция — Водонагреватели — Газ — Душевые кабины — Зеркала — Канализация, водопровод — Мебель для ванной — Мойки — Насосы — Полотенцесушители — Радиаторы — Сантех-Инструмент — Сиденье д/унит. — Система вентиляции и дымоходов — Смесители — Теплый пол — Унитазы, раковины, поддоны — Фильтры АКВАФОР — Фильтры БАРЬЕР — Фильтры ГЕЙЗЕР — Шланги, сифоны,манжеты
Сотовый поликарбонат
Спец. одежда
— Белье трикотажное, Джемпер, Футболка — Жилеты — Кепки/шапки — Костюмы лето — Костюмы, брюки зимние — Медицина, повара,продавцы — Обувь — Халаты
Спорт товары
Сухие смеси
Электро/бензо-инструмент
Электротовары
Доска | Профиль (труба) | Двери | Теплоизоляция | Линолиум | Кирпич
Низкие цены и широкий выбор бензинового и электроинструмента!
Сортировка: По умолчаниюНазвание (А — Я)Название (Я — А)Цена (низкая > высокая)Цена (высокая > низкая)Рейтинг (начиная с высокого)Рейтинг (начиная с низкого)Модель (А — Я)Модель (Я — А)
Показать: 18255075100
Показано с 1 по 18 из 1593 (всего 89 страниц)
Каталог
+7 (3466) 671-691
г. Нижневартовск,
ул. Индустриальная,д.14 стр.13
Быстрый заказ
Узнать статус заказа Войти
ГлавнаяКаталог Электро Бензо Инструмент
Дрель-шуруповерт Интерскол 14,4В ДА-10/14,4 Л2 (2 аккум.350-1350 о/мин,1,5Ач, Li-ion ) кейс
5900 ₽/шт
В корзину
В сравнение
Машина полировальная INGCO 1200Вт, 1500-3800 об/мин, алюм.корпус+оснастка АР 12001
9990 ₽/шт
В корзину
В сравнение
Машина сверлильная реверсивная ИНТЕРСКОЛ Д-10/420Э
2450 ₽/шт
В корзину
В сравнение
Рубанок GHO 15-82 Bosch (600 Вт 82 мм 0-1,5 мм)
7900 ₽/шт
В корзину
В сравнение
Гайковерт MAKITA DTW285 RME аккум. б/щет,18В, 2х4Ач Li-ion, 0-1800/2600/3500у/м,280Нм,квадр1/2,1,7кг
33800 ₽/шт
В корзину
В сравнение
Дрель-шуруповерт Интерскол 18Вт ДА-13/18 Л3 (2 аккум.400-1400 о/мин,1,5Ач, Li-ion ) кейс
11800 ₽/шт
В корзину
В сравнение
Шуруповерт Макита аккум. DF 457 DWE (Li-lon 18 В,2 аккум,1,5 а/ч, БЗП 13мм,400-1400 о/мин 42/24Нм)
12700 ₽/шт
В корзину
В сравнение
Перфоратор Makita HR 2630 (800 Вт 2.9 Дж 3 режима) 2,9кг
19200 ₽/шт
В корзину
В сравнение
Машина шлиф. угл Интерскол 150мм УШМ-150/1300Вт 8500об коробка
6990 ₽/шт
В корзину
В сравнение
Шуруповерт Bosch аккум GSR 140-LI / (14,4 В 2 аккум 1,5 А/ч БЗП 13 мм)
10800 ₽/шт
В корзину
В сравнение
Масляный радиатор ОММ Ресанта 0,7 кВт 7 секций
2050 ₽/шт
В корзину
В сравнение
Бензоэлектростанция WESTER GNB2800A 2.8кВт,220В 50Гц бак
20500 ₽/шт
В корзину
В сравнение
Машина шлиф. угл Интерскол 180мм УШМ-180/1800Вт 8000об коробка
10600 ₽/шт
В корзину
В сравнение
Плиткорез STURM ТС9811 (1300Вт,алмазн. диск 110мм,14200об/мин)
2850 ₽/шт
В корзину
В сравнение
Лобзик Макита 4329 К Х1 (450 Вт маятниковый ход,чемодан )
5700 ₽/шт
В корзину
В сравнение
Машина шлиф.вибро Bosch GSS 23 А
7500 ₽/шт
В корзину
В сравнение
Масляный радиатор ОМПТ Ресанта 2,5 кВт 12 секций
3650 ₽/шт
В корзину
В сравнение
Дрель-миксер HAMMER UDD600M 600Вт 13мм 0-800об/мин
4050 ₽/шт
В корзину
В сравнение
Показать все товары Доборные элементы кровли Металлочерепица Мягкая кровля Профнастил C-21 Профнастил Н-60 Профнастил С-44 Профнастил С-8 Уплотнитель Фальцевая кровля Конек Профнастил СС-10 Профнастил НС-35
Показать все товары Доборные элементы фасада Сайдинг «Блок-Хаус» Сайдинг «Евробрус» Фасадные кассеты Фасадные панели Сайдинг «Корабельная доска» Панели ПСМ Элементы подконструкции
Показать все товары Ветрозащита ПАРО-изоляция ГИДРО-изоляция Утеплитель Скорлупа для трубопровода
Показать все товары Труба круглая, уголок Арматура, круг, квадрат, сталь Труба профильная, швеллер, полоса Нержавейка, лист алюминевый
Показать все товары Калькулятор водосточной системы Металлическая водосточная система Пластиковая водосточная система VERAT
Показать все товары Поликарбонат и профиля Теплицы и комплектующие Грядки металлические
Показать все товары Для утеплителя Дюбель Заклепки Кровельные саморезы Пресс-шайба Саморезы по металлу Саморезы по дереву Болты, шайбы, гайки Шурупы универсальные Шпильки резьбовые Троса и цепи
Показать все товары Лист под заказ Лист со склада
Показать все товары Штакетник металлический
Показать все товары Панели Сэндвич и подоконники Оконные конструкции Комплектующие
Показать все товары Гидроизоляционные материалы Вилатерм Пакля, джут, дарнит, войлок, ватин Лента изоляционная Скотч, лента, изолента
Показать все товары
Лопаты и грабли
Показать все товары Инструмент измерительный Инструмент малярный и штукатурный Буры и сверла Ключи, отвертки Инструмент ручной Инструмент слесарно-столярный Расходники
Показать все товары Грунтовка, мастика, праймер Растворители Лак, морилка, пропитка, колер Пена, герметик, очиститель Эмаль и краска
Показать все товары Шпатлевка, штукатурка , ровнитель
Показать все товары Керамогранит, плитка Плитка тратуарная Кирпич, блоки
Показать все товары ДВП, ДСП, МДФ Плита ОСБ Фанера Асбокартон
Показать все товары Лазерная резка алюминия Лазерная резка нержавеющей стали Лазерная резка черной стали до 10 мм
Показать все товары Средства защиты Сварка Сварочные аппараты, маски, щитки Электроды, лампа паяльная
Показать все товары Технические газы Баллоны
Показать все товары Ворота, качели, скамейки, контейнер
Показать все товары Изделия из окрашенной стали Изделия из оцинкованной стали
Показать все товары Электро Бензо инструмент
Показать все товары Кабели, провода, удлинители Лампы и батарейки Розетки, выключатели, вилки Светильники, фонари
Показать все товары ГКЛ Комплектующие
Показать все товары Сетка, проволока
Показать все товары Порошковое окрашивание
- Документы
- Цены
- Новости
- Видео
- Акции
- О компании
- Доставка
- Оплата
- Контакты
Бензо-Электро инструмент в Волгограде — адрес, телефон, отзывы
—
Магазин Бензо-Электро инструментов
- org/PostalAddress»>
Телефон
- +7-988-962-27-77
Режим работы
Ежедневно с 8:00 до 20:00, без перерывовСайт
- volgainstrument.ru
E-mail
- volgainstrument@mail. ru
Юридическое название
ИП Кондрашов А.В.Категория
- Насосы, насосные станции в Волгограде
- Инструмент для деревообработки в Волгограде
- Электротехника в Волгограде
- Пневмооборудование, компрессоры в Волгограде
- Электрический инструмент в Волгограде
- Инструменты для слесарно-монтажных работ в Волгограде
- Инструменты с бензиновым двигателем в Волгограде
- Оборудование для сварки в Волгограде
Адрес
г. Волгоград, Елецкая, 21 («Парус», цокольный этаж)Рейтинг компании
О компании
Информация о магазин бензо-электро инструментов «Бензо-Электро инструмент» в Волгограде (рейтинг 5)
«Бензо-Электро инструмент» находится в Волгограде по адресу: Елецкая, 21.
Деятельность компании «Бензо-Электро инструмент» в Волгограде относится к насосам, насосным станциям, инструментам для слесарно-монтажных работ, электрическому инструменту.
Для консультации вы можете позвонить по телефону +7-988-962-27-77.
Также посетите наш сайт.
Отзывы о компании «Бензо-Электро инструмент»
Добавить отзыв о компании
Оставить отзыв о компании
Похожие компании рядом
ЭнергоКонтроль
обособленное подразделение по г. волгограду
Fasstera
торговая компания
Скупка №1
Новелла
оптовая компания
Магазин хозтоваров
Арсенал Электрик
сеть магазинов
Рассказать о компании:
Добавить отзыв о компании
- Распечатать
Смотрите также
Торговая компания А-ПРОФИТ
Магазин Бриз
Строительно-торговая компания РСК Мастер
Бензо-электро-инструмент
- Сани и принадлежности к ним
- Техника в сборе
- Питбайки
- Мотоциклы и трициклы
- Квадроциклы
- Мотоцикл Скаут и доп. оборудование
- Мопеды и Скутера
- Электрические дет. квадроциклы,машинки, гироскутер
- Мотобуксировщики и доп. оборудование
- Мотоблоки
- Двигатели LIFAN в сборе
- Zongshen, Weima
- Двигатели Lifan разных модификаций
- Двигатели Lifan c сцеплением автомат (R-серия) с редуктором 2:1
- Базовые двигатели Lifan
- Двигатель Lifan c ручным и электо стартером 12В (D-серия)
- Дизельные двигатели Lifan
- Двигатели LIFAN с ручным стартером
- Двигатели LIFAN с ручным и электро стартером
- Двигатели в сборе для китайской мототехники
- Велосипеды в сборе
- Велосипеды 12″-19″
- Велосипеды 20″ 24″ 26″
- Горные Велосипеды
- Велосипеды 27,5″ 28″ 29″
- Велосипеды с двигателем
- Велосипеды для детей (с 4-6 лет) 18″
- Велосипеды женские
- Велосипеды для детей (от 2-4 лет) 14″
- Велосипеды для детей (5-10 лет) 20″
- Велосипеды для детей (3-5 лет) 16″
- Велосипеды складные 20″, 24″, 26″
- Велосипеды с амортизатором в раме
- Самокаты, беговелы
- Запчасти для Велотехники
- Велокамеры и велопокрышки
- Велоэкипировка
- Обода, камеры, покрышки, насосы для велосипеда
- Подшипники
- Запчасти Shimano и MicroSHIFT
- Грипсы и сидения для велосипеда
- Аксесуары и инструмент для велосипедов
- Навесное для велосипеда
- Педали, втулки, каретки, шатуны
- Тормозная система для велосипеда
- Звезды/Цепи/Защита цепи
- Переключатели скоростей
- Запчасти для японских скутеров Honda, Yamaha, Suzuki
- Навесное
- Электрика
- Троса и прокладки
- Коленвал, подшипники, ЦПГ, поршни, кольца, голова
- Топливная система
- Трансмиссия
- Запчасти для советских мотоциклов и мопедов
- Запчасти для мотоцикла Ява
- Запчасти для мотоцикла Иж
- Кузовные элементы и оптика ИЖ
- Запчасти двигателя
- Звезды и цепи
- Топливная система/ выхлоп
- Тормозная система, рычаги, троса, покрышки, камеры Иж
- Подшипники,сальники, прокладки, втулки, метизы на Иж
- Электрика
- Запчасти для мотоцикла Урал
- Навесное, метизы, подшипники
- Запчасти к двигателю
- Топливная система/ выхлоп
- Трансмиссия
- Тросы, сальники, прокладки
- Электрика и оптика Урал
- Запчасти для мотоцикла Днепр
- Запчасти для мотоцикла Минск, Восход
- Запчасти для Российских мопедов
- Мотороллер Муравей
- Масла и химия
- Запчасти на японские мотоциклы и мопеды
- Запчасти на Honda CB400
- Yamaha YBR 125
- Бензо-электро-инструмент
- Бензопилы и бензотримеры
- Насадки на бензопилы мотокосы
- Запчасти для бензоинструмента
- Цепи, звездочки, барабаны, шины для бензопил
- Запчасти двигателя бензопил разных моделей
- Запчасти для бензопил разных моделей
- Запчасти для бензопилы Тайга, Урал
- Запчасти для мотокос и насадк к ним
- Запчасти для китайских бенздопил «Цыганка» ( тип -38/-45/-52 и т. д.)
- Двигатель и запчасти для веломотора
- Мото аксессуары
- Машинки детские
- Мото аксессуары
- Расходники, доп оборудования для мототехники
- Цепи приводные (бухтами)
- Зеркала заднего вида и держатели телефона на руль
- Лампочки/ ДХО
- Указатели поворота
- Щитки ветровые (ветровики)
- Подшипники
- Аккумуляторы
- Аудиосистема
- Универсальные гофры и амортизаторы
- Брелоки
- Биксенон/ Ксенон для мототехники
- Противоугонные средства/ сигналы
- Кофры/ корзины
- Свечи/ Насвечники
- Универсальные глушители для мототехники
- Ручки руля, защита руля
- Электрические моточасти универсальные
- Фильтры (универсальные)
- Мотоэкипировка, мотоодежда
- Очки
- Шлемы
- Модуляр
- Интегралы
- Аксессуары к шлемам, стекла
- Трансформеры
- Кроссовые, туринг
- Открытые
- Детские
- Перчатки
- Мотокуртка
- Мотоботы
- Защита
- Сумки, нашивки
- Подшлемники, платки, татуировки
- Мотоштаны
- Покрышки и камеры для мото и вело техники
- Покрышки ATV (для квадроциклов) 6″-9″
- Покрышки 17″
- Покрышка 19″-21″
- Покрышка 18″
- Покрышка 13″-16″
- Покрышка 10″- 12″
- Велопокрышки
- Мотопокрышки
- Мотокамеры
- Ремкомплекты резины, ниппеля, колпачки
- Покрышки ATV (для квадроциклов) 10″-14″
- Запчасти для двигателя GB270 ZONGSHEN
- Запчасти для двигателей LIFAN
- Запчасти для двигателя Lifan 1Р52F — 1Р54F
- Сцепление, вариатор, редуктор для двигателей
- Комплект электрооборудования для двигателей Lifan
- Запчасти для двигателей LIFAN 2V77F-A, 2V78F (24, 27 лс) (Буран)
- Запчасти для двигателей LIFAN 168-FA2 (МБ-2М), 160F — 192F (от 4 до 15 лс. ), 168F-R
- Запчасти для разных двигателей LIFAN
- Запчасти для двигателей LIFAN KP230 KP420 KP460 KP
- Запчасти для Питбайков
- Колесные диски
- ЗАПЧАСТИ ДЛЯ ПИТБАЙКОВ, ТИПА FIGHTER 125 (TTR 125)
- Тюнинг для кроссовой техники
- Запчасти для двигателя 1P56FMJ, YX140 140 СМ3 KAYО
- Запчасти ДЛЯ ПИТБАЙКА BSE Ph20-125
- Для мопеда X-MOTOS 125 и 140 ЗИП для питбайка X-MOTOS XB-88 (CB250)
- Запчасти для мотоблоков/ генераторов и мотопомп
- Запчасти для мотоблока/минитрактора МБ8Д-МБ10Д, Сигма
- Запчасти для мотоблока Крот
- Запчасти для мотоблоков Weima WM
- Запчасти и навесное для мотоблоков Каскад, Нева
- Запчасти для двигателя R180, R190, R192, R195 Дизель
- Запчасти и навесное для мотоблока Агрос
- Запчасти для мотоблоков 2
- Запчасти для снегоходов Буран
- Запчасти для снегоходов Тайга
- Запчасти для снегоходов 2
- Запчасти для снегохода SnowFox, SnowMax, Cronus, S2, Motoland, TaoTao
- Запчасти для снегохода Рысь
- Запчасти для электро велосипедов, ATV
- Запчасти для мото самокатов
- Запчасти для лодочных моторов
- Запчасти для иностранных лодочных моторов
- Запчасти Вихрь
- Запчасти Ветерок
- Запчасти для снегоуборочных машин
- Запчасти для китайских мопедов
- Запчасти Vortex Citi
- Запчасти Shuriken
- Запчасти Rubikon Sport
- Запчасти Forester Street
- Запчасти мопед Flash
- Запчасти Crosstrack
- Запчасти Racer Alpha RC50 2015, RAID
- Запчасти трицикл Delta Cargo, мопед Evolution (спец), Colt, Vega
- Запчасти Vortex Alpha 2017
- Запчасти мопед Trikler
- Запчасти мопед Joyride
- Запчасти мопед Stingray
- Запчасти Alpha Delta (универсальные)
- Запчасти для мопеда Alpha
- Запчасти для мопеда Sigma
- Запчасти Storm Indigo, Storm Cross
- Запчасти Nitro (СКУТЕРЕТТА, HORNET)
- Запчасти Gvalior Chopper, Gvalior Street, Jordan, Jordan Evo, Sprinter
- Запчасти для двигателя 1Р54FMI 1P54FMH 125cc
- Запчасти для двигателя 1Р39FMА, 1Р54FMI
- Запчасти для китайских скутеров
- YH50QT-17 /JUMBO, YH50QT-J/ PIRANIA 50, YH50QT-M /COBRA, YY50QT-28 / KINETIK 50
- 150 WARRIOR JET LB150T-8 (BD150QT-4A-BK), GYRO, 2020 QUANTUM, 2020 WIZARD LED, TEMPO
- ACTIVE TORRO
- 2019 JOGGER
- MATADOR EVA
- WIZARD
- CITY JOG 3
- CITY PG
- 2019 SLASH, 2019 ORBIT
- 2019 IRIS
- WY50(150)Q-2A / MATADOR 50 (150)
- FT50QT-4A /CLEVER, FLAIER, TORNADO, Z50R, FORCE, URBANRACER, LK50QT-14
- FT50QT-18 /LEOPARD, FOX, THUNDER, TRITON, MT50QT-19A, JOKER
- BD50QT-2-F2 SCORPION, BD50QT-2-F3 RAPIRA, LB50QT-40 /ТRAСER, RAZOR И TANJER
- LB50QT-35 (QT-10) /SPORT, BOOSTER, NIRVANA, X-FIRE, STALKER, CHALLENGER, MAJOR, MT150
- FT50QT ACTIV, TERRA, PILOT
- BD50QT-3-1 ACTIV NOVO / ACTIVE TRACK LB50QT-16, STALKER 50 (YHXTE), DEXTER, VIPER
- MIRAGE И DESTRA RAPIRA, PIAGGIO
- Запчасти для двигателя 139QMB, GY6-50
- Запчасти для двигателя 1Е41QMB, ТВ50, SUZUKI RUN, 1Е40QMB
- Запчасти для двигателя 152QMI, 157QMJ,GY6-125/150 125-150 сс
- Запчасти для китайских мотоциклов
- RACER RC250CK NITRO
- RACER RC250CK-N FIGHTER
- RACER RC250GY-C2 PANTHER
- IRBIS GR250, IRBIS GS200, 2012 IRBIS VJ, IRBIS TTR 250
- Запчасти мотоциклов Fireguard Trial 250, Racer rc200lt Forester, Comandor, 200 куб. см, Crossmaster Sport, Fireguard 250
- RACER RC150-23A TOURIST
- RACER RC150-23 TIGER
- CENTURION, FABIO
- BRIAR SPEEDFIRE 250СМ3 CTM250-3, CTM250-4, FALCON SHADOW DESOPERADO 250СМ3 CTM250-4
- FALCON SPEEDFIRE 250СМ3CTM250-4
- FIGHTER TSR 250
- МИНСК, ХАНТЕР, SIMPLER, КАНТРИ
- Centurion Bitrix
- Запчасти для мотоцикла Cobra Crossrire, RC250-C5B
- APACHE SPORT ОБВЕСЫ ОБЛИЦОВКА (APACHE SPORT), APACHE ОБВЕСЫ ОБЛИЦОВКА, FIGHTER 150 STREET, VIRUS 250 СМ3, FALCON TERRAIL 250
- Запчасти для двигателей 167FMM, Zongshen CB250 ZS 170MM-2, Zongshen CB250 ZS 172FMM
- Запчасти для двигателя ZS190E, ZS1P62YML-2, Bullet 150 HQ150
- Запчасти для двигателя 1P56FMJ-2
- Запчасти для двигателя Zongshen CB250 ZS 174MN-3
- Запчасти для двигателей CG125-250, 157FMI-169FMM
- Запчасти для двигателя Jaegger 200, 163FML-2MP, 164FML
- Запчасти для двигателей 253FMM Briar SpeedfireCTM250-3, CTM250-4,CG125 156FMI нижний рв, CG150 162FMJ нижний рв
- ДВИГАТЕЛЬ 4Х ТАКТ ГОРИЗОНТАЛЬНЫЙ R07-GY60 С НИЖ. ЭЛ.СТАРТЕРОМ НИЖ.РАСПРЕДВАЛ
- ЦЕПИ SFR, QINQI (SUZUKI) 250GS, QM250GY, КАРБЮРАТОРЫ NIBBI RACING, ZONGSHEN NC250 ZS 177
- ЗАПЧАСТИ ДЛЯ ТРИЦИКЛОВ LIFAN
- Тормозные колодки для квадро-мото техники
- Аккумуляторы на технику
- КАРБЮРАТОРЫ MIKUNI
- Запчасти для квадроциклов / ATV
- Для квадроцикла Termit, Termit sport, City 50(110) LM ATV-110F, Grom 110
- Для квадроцикла Termit Libre, LM ATV-110G /Termit Tactic, LM ATV-110M
- Запчасти для квадроцикла Pantera 125
- Запчасти для квадроциклов AVENGER ZLA150-6, ENERGY ZLA150-9
- Запчасти для квадроциклов LX200ATV-M BAGGIO, LX50ATV-2 ВAGGIO
- Запчасти для квадрациклов PANTERA 250, WASABI ZLA250-9
- Запчасти для квадрроциклов CF, ADVANT ZLA250-4, STING 110 (150)
- Запчасти для квадроциклов BEORN 200, GROM 200, LINHAI-YAMAHA ATV300/400, STELS
- Запчасти для квадроцикла ATV Target Next
- Запчасти для квадроцикла AVENGER TUNGUS МОДЕЛЬ LMATV-250HM
- Запчасти для квадроцикла ATOMIK LMATV-110G
- Запчасти для квадроцикла ATV110/125 RIDER КВ. ФАРЫ (МОТОЛЕНД) (ATOMIK TT)
- Запчасти для квадроцикла LX250 BAGGIO250, 2019 ATV COMMANDER 200
- Запчасти для квадроцикла KAYO BULL 150
- Запчасти для квадроцикла ATV125 FOX (МОТОЛЭНД), TERMIT TT
- Запчасти для квадроцикла ATV COMMANDER APL110S
- Запчасти для квадроцикла ATV SPORTY
- Запчасти для квадроцикла GIRO, ARMADA (АРМАДА) 150/200/250
- Запчасти для квадроцикла 2020 ATV WILD
- Запчасти для квадроцикла 2020 ATV WILD TRACK
- ДЛЯ КВАДРОЦИКЛА TARGET TREK 50 LMATV-049HM/ SPRINT TREK 50 LMATV-049T, ATOMIK ZLA70-4
- Запчасти для квадроцикла 2021 HAMMER 2 и троса для ATV
- Запчасти для квадроцикла SPORTY (СПОРТИ)
- Запчасти для квадроцикла ATV COMMANDER CROSS, TERMIT ТТ, 2020 BRAVO
- Запчасти для разных квадрациклов
- Запчасти для двигателя квадроцикла Hammer 200 , Commander 200
Electro Benzo (Original Mix) от Johnny Beast на Beatport
Трек
Ссылка:
Вставить:
художников Джонни Зверь
- Выпускать 87″ data-ec-variant=»album» data-ec-id=»93923″ data-ec-d1=»Johnny Beast» data-ec-d2=»Utmost DJ»>
- Длина 6:48
- Вышел 2008-01-31
- ударов в минуту 130
- Ключ майор
- Жанр Основной этап | Электро Хаус
- Этикетка Аккамузик
Расшифровать Оригинальный микс
Черногория
29″ data-ec-variant=»track» data-ec-id=»554420″ data-ec-d1=»Sandy Vee» data-ec-d2=»John From The Hill» data-ec-d3=»Mainstage» data-ec-d4=»Electro House»>Достаточно громко? Оригинальный микс
Майк Баланс
29″ data-ec-variant=»track» data-ec-id=»532738″ data-ec-d1=»Jonathan Landossa» data-ec-d3=»Mainstage» data-ec-d4=»Electro House»>Тектоник Оригинальный микс
Пикафеллер
Carl Henry» data-ec-creative=»Recommended Tracks» data-ec-brand=»Hi-Bias Records» data-ec-category=»Tracks» data-ec-list=»Recommended Tracks» data-ec-price=»1.29″ data-ec-variant=»track» data-ec-id=»519337″ data-ec-d1=»Nick Fiorucci» data-ec-d2=»Etienne Ozborne» data-ec-d3=»Mainstage» data-ec-d4=»Electro House»>Медовый Рок-даб-микс Манюса и Дарио Гуиды
Манюс, П. С.М.
Горячая 4, которую вы переделываете Але Авила переделка
Эль Авила
мистика Побитовый ремикс
Тебя-О
Martina» data-ec-creative=»Recommended Tracks» data-ec-brand=»Rok-It Recordings» data-ec-category=»Tracks» data-ec-list=»Recommended Tracks» data-ec-price=»1.29″ data-ec-variant=»track» data-ec-id=»478766″ data-ec-d1=»Frank Pellegrino» data-ec-d2=»Fama» data-ec-d3=»Mainstage» data-ec-d4=»Electro House»>Музыка в моей голове Риктаун Ремикс
Джон Ревокс
29″ data-ec-variant=»track» data-ec-id=»469375″ data-ec-d1=»Jan van Lier» data-ec-d3=»Mainstage» data-ec-d4=»Electro House»>
Быть вместе Джон с холма Ремикс
Сэнди Ви
Я чувствую тебя Оригинальный микс
Джонатан Ландосса
Just Like That подвиг. Карл Генри Этьен Озборн Микс
Ник Фиоруччи
Наблюдая за тобой подвиг. Мартина Сталкер Микс Фамы
Фрэнк Пеллегрино
Ночной огонь Оригинальный вокальный микс
Ян ван Лиер
Electro Benzo (Original Mix) от Johnny Beast на Beatport
Трек
Ссылка:
Вставить:
художников Джонни Зверь
- Выпускать
- Длина 6:48
- Вышел 2014-09-05
- ударов в минуту 130
- Ключ майор
- Жанр Дом техники
- Этикетка Электро Суперзвезда
- 29″ data-ec-variant=»track» data-ec-id=»5803873″ data-ec-d1=»Gary Caos» data-ec-d3=»Tech House»>
Колумбийская душа Оригинал
Д. Рамирес, Марк Найт
29″ data-ec-variant=»track» data-ec-id=»5786312″ data-ec-d1=»Audision» data-ec-d3=»Tech House»>Бал-маскарад Catz ‘n Dogz Mix
Ремесло
29″ data-ec-variant=»track» data-ec-id=»5780810″ data-ec-d1=»Andreas Henneberg, Fabian Reichelt» data-ec-d3=»Tech House»>Ангел Даб-микс Soul Cartel
ОНО
29″ data-ec-variant=»track» data-ec-id=»5755320″ data-ec-d1=»Hanne, Lore» data-ec-d3=»Tech House»>Сжимать Оригинальный микс
Бесшовные
29″ data-ec-variant=»track» data-ec-id=»5738853″ data-ec-d1=»UMEK, Simon Doty» data-ec-d3=»Tech House»>Барбей (Ронан Портела Ремикс) Оригинальный микс
Кто-нибудь другой
Только выпуск
29″ data-ec-variant=»track» data-ec-id=»5737473″ data-ec-d1=»Someone Else» data-ec-d2=»Josh Wink» data-ec-d3=»Tech House»>Спальня Глаза Оригинальный микс
Кто-нибудь другой
Только выпуск
29″ data-ec-variant=»track» data-ec-id=»5732266″ data-ec-d1=»Prune Flat» data-ec-d3=»Tech House»>Друзья всегда подвиг. Джоселин Браун Paolo Madzone Zampetti и Steve Paradise Darksax Dub Remix
Бен Гур, Джоселин Браун
29″ data-ec-variant=»track» data-ec-id=»5710929″ data-ec-d1=»Aaron Snapes» data-ec-d3=»Tech House»>Капли воды Оригинал
Пол С и Паоло Мартини
29″ data-ec-variant=»track» data-ec-id=»5699694″ data-ec-d1=»Renato Pezzella» data-ec-d3=»Tech House»>
Женщина Оригинальный микс
Гэри Каос
Первый контакт Оригинальный микс
Прослушивание
Fallin подвиг. Фабиан Райхельт Оригинальный микс
Андреас Хеннеберг, Фабиан Райхельт
Дер Гитарренвемсер Оригинальный микс
Ханне, Знание
Божественный Оригинальный микс
УМЭК, Саймон Доти
Lowdown Brittle (Глубокая звуковая интерпретация Винка) Оригинальный микс
Кто-нибудь другой
Только выпуск
Обещания Оригинальный микс
Чернослив Флэт
Космический бас Оригинальный микс
Аарон Снейпс
Джунгли оригинальный микс
Ренато Пеццелла
29″ data-ec-variant=»track» data-ec-id=»5658238″ data-ec-d1=»David Pher» data-ec-d3=»Tech House»>Нормкор Оригинальный микс
Дэвид Фер
Электроакупунктура для прекращения длительного приема бензодиазепинов: рандомизированное контролируемое исследование
Сохранить цитату в файл
Формат: Резюме (текст)PubMedPMIDAbstract (текст)CSV
Добавить в коллекции
- Создать новую коллекцию
- Добавить в существующую коллекцию
Назовите свою коллекцию:
Имя должно содержать менее 100 символов
Выберите коллекцию:
Не удалось загрузить вашу коллекцию из-за ошибки
Повторите попытку
Добавить в мою библиографию
- Моя библиография
Не удалось загрузить делегатов из-за ошибки
Повторите попытку
Ваш сохраненный поиск
Название сохраненного поиска:
Условия поиска:
Тестовые условия поиска
Эл. адрес: (изменить)
Который день? Первое воскресеньеПервый понедельникПервый вторникПервая средаПервый четвергПервая пятницаПервая субботаПервый деньПервый будний день
Который день? ВоскресеньеПонедельникВторникСредаЧетвергПятницаСуббота
Формат отчета: SummarySummary (text)AbstractAbstract (text)PubMed
Отправить максимум: 1 шт. 5 шт. 10 шт. 20 шт. 50 шт. 100 шт. 200 шт.
Отправить, даже если нет новых результатов
Необязательный текст в электронном письме:
Создайте файл для внешнего программного обеспечения для управления цитированием
Полнотекстовые ссылки
Эльзевир Наука
Полнотекстовые ссылки
Рандомизированное контролируемое исследование
. 2019 фев; 109:59-67.
doi: 10.1016/j.jpsychires.2018.11.015. Epub 2018 22 ноября.
Винг-Фай Юнг 1 , Ка-Фай Чунг 2 , Чжан-Цзинь Чжан 3 , Ши-Пин Чжан 4 , Вай-Чи Чан 2 , Роджер Мэн-Кин Нг 5 , Конни Лай-Ва Чан 6 , Лай-Мин Хо 7 , Бренда Йи-Ман Ю 8 , Джанет Чинг-Сум Чау 3 , Новелла Чи-Линг Лау 3 , Ли-Син Лао 3
Принадлежности
- 1 Школа медсестер, Гонконгский политехнический университет, Специальный административный район Гонконг. Электронный адрес: [email protected].
- 2 Кафедра психиатрии Гонконгского университета, Специальный административный район Гонконг.
- 3 Школа китайской медицины Университета Гонконга, Специальный административный район Гонконг.
- 4 Школа китайской медицины, Гонконгский баптистский университет, Специальный административный район Гонконг.
- 5 Отделение психиатрии, больница Коулун, Специальный административный район Гонконг.
- 6 Отделение психиатрии Объединенной христианской больницы, Специальный административный район Гонконг.
- 7 Школа общественного здравоохранения Университета Гонконга, Специальный административный район Гонконг.
- 8 Школа медсестер, Гонконгский политехнический университет, Специальный административный район Гонконг.
- PMID: 30504097
- DOI: 10.1016/j.jpsychires.2018.11.015
Рандомизированное контролируемое исследование
Wing-Fai Yeung et al. J Psychiatr Res. 2019 фев.
. 2019 фев; 109:59-67.
doi: 10.1016/j.jpsychires.2018.11.015. Epub 2018 22 ноября.
Авторы
Винг-Фай Юнг 1 , Ка-Фай Чунг 2 , Чжан-Цзинь Чжан 3 , Ши-Пин Чжан 4 , Вай-Чи Чан 2 , Роджер Мэн-Кин Ng 5 , Конни Лай-Ва Чан 6 , Лай-Мин Хо 7 , Бренда Йи-Ман Ю 8 , Джанет Чинг-Сум Чау 3 , Новелла Чи-Линг Лау 3 , Ли-Син Лао 3
Принадлежности
- 1 Школа медсестер, Гонконгский политехнический университет, Специальный административный район Гонконг. Электронный адрес: [email protected].
- 2 Кафедра психиатрии Гонконгского университета, Специальный административный район Гонконг.
- 3 Школа китайской медицины Университета Гонконга, Специальный административный район Гонконг.
- 4 Школа китайской медицины, Гонконгский баптистский университет, Специальный административный район Гонконг.
- 5 Отделение психиатрии, больница Коулун, Специальный административный район Гонконг.
- 6 Отделение психиатрии Объединенной христианской больницы, Специальный административный район Гонконг.
- 7 Школа общественного здравоохранения Университета Гонконга, Специальный административный район Гонконг.
- 8 Школа медсестер, Гонконгский политехнический университет, Специальный административный район Гонконг.
- PMID: 30504097
- DOI: 10.1016/j.jpsychires.2018.11.015
Абстрактный
Задача: Оценить эффективность использования электроакупунктуры в качестве дополнительного лечения для увеличения частоты прекращения приема бензодиазепинов у лиц, длительно употребляющих бензодиазепины.
Методы: Это было рандомизированное контролируемое исследование, в котором не участвовали оценщики и участники. Сто сорок четыре человека, длительно принимающих бензодиазепины, были случайным образом распределены для получения либо электроакупунктуры, либо плацебо-акупунктуры (фиктивное вмешательство с использованием неинвазивных игл плацебо) в сочетании с постепенным снижением дозы бензодиазепинов в течение 4 недель. Первичным исходом была частота прекращения употребления бензодиазепинов. Субъектов оценивали по употреблению бензодиазепинов, симптомам отмены бензодиазепинов, тяжести бессонницы, а также симптомам тревоги и депрессии на исходном уровне, на 6-й и 16-й неделе.
Полученные результаты: Частота прекращения лечения в группах электроакупунктуры и плацебо-акупунктуры через 12 недель после лечения составила 9,17% и 10,83% соответственно. Обе группы показали снижение использования бензодиазепинов при самостоятельном заполнении записи о приеме лекарств на 16-й неделе (по сравнению с исходным уровнем: группа электроакупунктуры -40,23% по сравнению с группой плацебо-акупунктуры -48,76%). Тем не менее, не было обнаружено существенных межгрупповых различий в частоте прекращения приема бензодиазепинов, снижении использования бензодиазепинов и других вторичных показателях во всех временных точках исследования.
Выводы: Электроакупунктура показала такую же скорость прекращения использования бензодиазепинов, что и неинвазивная плацебо-акупунктура у долгосрочных пользователей в течение 4-недельного графика постепенного снижения дозы. Доказательства не подтверждают преимущества электроакупунктуры по сравнению с неинвазивной плацебо-акупунктурой в снижении бессонницы, беспокойства, депрессии или других симптомов отмены во время графика постепенного снижения дозы. Несмотря на 40-процентное снижение использования бензодиазепинов в обеих группах, эти эффекты можно отнести к неспецифическим эффектам акупунктуры.
Пробная регистрация: ClinicalTrials. gov № NCT02475538.
Copyright © 2018. Опубликовано Elsevier Ltd.
Похожие статьи
Электроакупунктура для прекращения длительного употребления бензодиазепинов: протокол рандомизированного контролируемого исследования.
Yeung WF, Chung KF, Zhang ZJ, Chan WC, Zhang SP, Ng RM, Chan CL, Ho LM, Yu YM, Lao LX. Юнг В.Ф. и соавт. BMC Комплемент Altern Med. 2017 31 марта; 17 (1): 183. дои: 10.1186/с12906-017-1692-5. BMC Комплемент Altern Med. 2017. PMID: 28359309 Бесплатная статья ЧВК. Клиническое испытание.
Прекращение приема бензодиазепинов среди пожилых людей, страдающих бессонницей, получавших когнитивно-поведенческую терапию в сочетании с постепенным снижением дозы: рандомизированное исследование.
Байярджон Л., Ландревиль П., Верро Р., Бошемен Ж.П., Грегуар Ж.П., Морин К.М. Байаржон Л. и соавт. CMAJ. 2003 11 ноября; 169(10):1015-20. CMAJ. 2003. PMID: 14609970 Бесплатная статья ЧВК. Клиническое испытание.
Электроакупунктура при остаточной бессоннице, связанной с большим депрессивным расстройством: рандомизированное контролируемое исследование.
Yeung WF, Chung KF, Tso KC, Zhang SP, Zhang ZJ, Ho LM. Юнг В.Ф. и соавт. Спать. 2011 1 июня; 34 (6): 807-15. дои: 10.5665/SLEEP.1056. Спать. 2011. PMID: 21629370 Бесплатная статья ЧВК. Клиническое испытание.
Обзор: Дополнительные фармакологические подходы к снижению дозы бензодиазепинов.
Уэльс Дж.В., Третьяк В. , МакХью Р.К., Вайс Р.Д., Богунович О. Уэлш Дж. В. и др. Наркотики Алкогольная зависимость. 2018 1 августа; 189: 96-107. doi: 10.1016/j.drugalcdep.2018.04.028. Epub 2018 31 мая. Наркотики Алкогольная зависимость. 2018. PMID: 298 Обзор.
Влияние мелатонина на прекращение приема бензодиазепинов и качество сна у взрослых, пытающихся прекратить прием бензодиазепинов: систематический обзор и метаанализ.
Райт А., Диболд Дж., Отал Дж., Стоунман С., Вонг Дж., Уоллес С., Даффет М. Райт А. и др. Наркотики Старение. 2015 дек;32(12):1009-18. doi: 10.1007/s40266-015-0322-5. Наркотики Старение. 2015. PMID: 26547856 Обзор.
Посмотреть все похожие статьи
Цитируется
Анализ медицинских услуг при бессоннице в Корее: ретроспективное поперечное исследование с использованием данных обзора и оценки медицинского страхования.
Сон С., Лим Ю.С., Ли Ю.С., Лим Д.Х., Ким Б.К., Ха И.Х. Сон С и др. Здравоохранение (Базель). 2021 22 декабря; 10 (1): 7. doi: 10.3390/healthcare10010007. Здравоохранение (Базель). 2021. PMID: 35052172 Бесплатная статья ЧВК.
Полуиндивидуализированная акупунктура при бессоннице и окислительном стрессе: рандомизированное двойное слепое симуляционное контролируемое исследование.
Yeung WF, Yu BY, Yuen JW, Ho JYS, Chung KF, Zhang ZJ, Mak DSY, Suen LK, Ho LM. Юнг В.Ф. и соавт. Естественный научный сон. 2021 21 июля; 13:1195-1207. doi: 10.2147/NSS.S318874. Электронная коллекция 2021. Естественный научный сон. 2021. PMID: 34321944 Бесплатная статья ЧВК.
Электроакупунктура при резистентной к лечению бессоннице: протокол исследования для рандомизированного, контролируемого, слепого пилотного клинического исследования.
Lim JH, Kim KO, Kim SH, Kang CW, Kim BK. Лим Дж. Х. и соавт. Открытый БМЖ. 2020 26 февраля; 10 (2): e034239. doi: 10.1136/bmjopen-2019-034239. Открытый БМЖ. 2020. PMID: 32107269 Бесплатная статья ЧВК.
Типы публикаций
термины MeSH
- 1 Институт генетики болезней сердца (IfGH), отделение сердечно-сосудистой медицины, Университетская клиника Мюнстера, D-48149, Мюнстер, Германия.
- 2 Институт фармацевтической и медицинской химии Мюнстерского университета, Corrensstr. 48, Мюнстер, D-48149, Германия.
- 3 Отделение биомедицинской инженерии, Центр исследования нарушений мембранной возбудимости, Центр биоэлектричества и аритмии сердца, Вашингтонский университет, Сент-Луис, Миссури, 63130, США.
- 4 Чембион, Университет Мюнстера, D-48149, Мюнстер, Германия.
- 5 Институт физиологии и патофизиологии, вегетативной физиологии, Марбургский университет им. Филиппа, Deutschhausstr. 1-2, 35037, Марбург, Германия.
- 6 Департамент биомедицинских наук Копенгагенского университета, Копенгаген, Дания.
- 7 Отделение неврологии, Университетская клиника Дюссельдорфа, Дюссельдорф, Германия.
- 8 Институт генетики болезней сердца (IfGH), отделение сердечно-сосудистой медицины, Университетская клиника Мюнстера, D-48149, Мюнстер, Германия. [email protected].
- 9 Чембион, Университет Мюнстера, D-48149, Мюнстер, Германия. [email protected].
- PMID: 35365746
- PMCID: PMC8976019
- DOI: 10.1038/s42003-022-03229-8
- 1 Институт генетики болезней сердца (IfGH), отделение сердечно-сосудистой медицины, Университетская клиника Мюнстера, D-48149, Мюнстер, Германия.
- 2 Институт фармацевтической и медицинской химии Мюнстерского университета, Corrensstr. 48, Мюнстер, D-48149, Германия.
- 3 Отделение биомедицинской инженерии, Центр исследования нарушений мембранной возбудимости, Центр биоэлектричества и аритмии сердца, Вашингтонский университет, Сент-Луис, Миссури, 63130, США.
- 4 Чембион, Университет Мюнстера, D-48149, Мюнстер, Германия.
- 5 Институт физиологии и патофизиологии, вегетативной физиологии, Марбургский университет им. Филиппа, Deutschhausstr. 1-2, 35037, Марбург, Германия.
- 6 Департамент биомедицинских наук Копенгагенского университета, Копенгаген, Дания.
- 7 Отделение неврологии, Университетская клиника Дюссельдорфа, Дюссельдорф, Германия.
- 8 Институт генетики болезней сердца (IfGH), отделение сердечно-сосудистой медицины, Университетская клиника Мюнстера, D-48149, Мюнстер, Германия. [email protected].
- 9 Чембион, Университет Мюнстера, D-48149, Мюнстер, Германия. [email protected].
- PMID: 35365746
- PMCID: PMC8976019
- DOI: 10. 1038/с42003-022-03229-8
Фармакологическая активация нормальных и связанных с аритмией мутантных калиевых каналов KCNQ1.
Seebohm G, Push M, Chen J, Sanguinetti MC. Сибом Г. и соавт. Цирк рез. 2003 14 ноября; 93(10):941-7. doi: 10.1161/01.RES.0000102866.67863.2B. Epub 2003 23 октября. Цирк рез. 2003. PMID: 14576198
Конформационные изменения ионного канала при гейтировании и возникающие электрофизиологические свойства: применение вычислительного подхода к кардиальному Kv7. 1.
Некузаде А, Рудый Ю. Некузаде А. и соавт. Прог Биофиз Мол Биол. 2016 Январь; 120 (1-3): 18-27. doi: 10.1016/j.pbiomolbio.2015.12.014. Epub 2015 30 декабря. Прог Биофиз Мол Биол. 2016. PMID: 26743208 Бесплатная статья ЧВК.
Мутации колокализованных остатков поровой спирали и трансмембранных сегментов S5 и S6 нарушают дезактивацию и модифицируют инактивацию K+-каналов KCNQ1.
Seebohm G, Westenskow P, Lang F, Sanguinetti MC. Сибом Г. и соавт. Дж. Физиол. 2005 г., 1 марта: 563 (часть 2): 359–68. doi: 10.1113/jphysiol.2004.080887. Epub 2005, 13 января. Дж. Физиол. 2005. PMID: 15649981 Бесплатная статья ЧВК.
D242N, мутация K V 7.1 LQTS раскрывает ключевой остаток для зависимости I Ks от напряжения.
Морено С., Оливерас А., Бартолуччи С., Муньос С., де ла Крус А., Пераса Д.А., Химено Х.Р., Мартин-Мартинес М., Севери С., Фелипе А., Ламбиасе П.Д., Гонсалес Т., Валенсуэла С. Морено С. и др. Дж Мол Селл Кардиол. 2017 Сентябрь; 110: 61-69. doi: 10.1016/j.yjmcc.2017.07.009. Epub 2017 22 июля. Дж Мол Селл Кардиол. 2017. PMID: 28739325
Новая мутация KCNQ1 в сегменте S5, которая нарушает его связь с KCNE1, ответственна за синдром укороченного интервала QT.
Морено К., Оливерас А., де ла Крус А., Бартолуччи К., Муньос К., Салар Э., Химено Х.Р., Севери С., Комес Н., Фелипе А., Гонсалес Т., Ламбиасе П., Валенсуэла К. Морено С. и др. Кардиовасц Рез. 2015 Сентябрь 1; 107 (4): 613-23. дои: 10.1093/cvr/cvv196. Epub 2015 13 июля. Кардиовасц Рез. 2015. PMID: 26168993
Эффективные возмущения фенобарбиталом на I Na , I K(erg) , I K(M) и I K(M) и I K(2DR) во время стимуляции нейробластомы Sro2-Pulse K(2DR) Клетки.
Ву П.М., Лай ПК, Чо ХИ, Чуанг ТХ, Ву С.Н., Ту Ю.Ф. Ву П.М. и др. Биомедицины. 2022 авг 13;10(8):1968. doi: 10.3390/biomedicines10081968. Биомедицины. 2022. PMID: 36009515 Бесплатная статья ЧВК.
- Йесперсен Т., Груннет М., Олесен СП. Калиевый канал KCNQ1: от гена к физиологической функции. Физиология. 2005; 20: 408–416. — пабмед
- Вробель Э., Тапкен Д. и Сибом Г. Танго KCNE — как KCNE1 взаимодействует с Kv7.1. Фронт. Pharmacol. 3, 142 (2012). — ЧВК — пабмед
- Эбботт Г. В., Гольдштейн С.А. Суперсемейство малых субъединиц калиевых каналов: форма и функция MinK-родственных пептидов (MiRP) Q Rev. Biophys. 1998; 31: 357–398. — пабмед
- МакКроссан З.А., Эбботт Г.В. Пептиды, родственные MinK. Нейрофармакология. 2004; 47: 787–821. — пабмед
- Пиччини М. и др. KCNE1-подобный ген удален при синдроме смежных генов AMME: идентификация и характеристика гомологов человека и мыши. Геномика. 1999; 60: 251–257. — пабмед
- R01 HL126774/HL/NHLBI NIH HHS/США
- R01 NS0/NS/NINDS NIH HHS/США
Джесперсен Т., Груннет М. и Олесен С.П. Калиевый канал KCNQ1: от гена к физиологической функции. Физиология 20 , 408–416 (2005).
КАС пабмед Google ученый
Вробель Э., Тапкен Д. и Сибом Г. Танго KCNE — как KCNE1 взаимодействует с Kv7.1. Перед. Фармакол. 3 , 142 (2012).
Abbott, GW & Goldstein, S.A. Суперсемейство малых субъединиц калиевых каналов: форма и функция MinK-родственных пептидов (MiRP). Q Rev. Biophys. 31 , 357–398 (1998).
КАС пабмед Google ученый
McCrossan, Z.A. & Abbott, G.W. Пептиды, родственные MinK. Нейрофармакология 47 , 787–821 (2004).
КАС пабмед Google ученый
Piccini, M. et al. KCNE1-подобный ген удален при синдроме смежных генов AMME: идентификация и характеристика гомологов человека и мыши. Genomics 60 , 251–257 (1999).
КАС пабмед Google ученый
Такуми Т., Окубо Х. и Наканиши С. Клонирование мембранного белка, индуцирующего медленный потенциалозависимый калиевый ток. Наука 242 , 1042–1045 (1988).
КАС пабмед Google ученый
Taylor, K.C. et al. Структура и физиологическая функция промежуточного состояния датчика напряжения канала KCNQ1 человека. Элиф 9 , e53901 (2020).
Барханин Дж. и др. Белки K(v)LQT1 и IsK (minK) связываются, образуя сердечный ток калия I-Ks. Природа 384 , 78–80 (1996).
КАС пабмед Google ученый
Sanguinetti, M.C. et al. Совместная сборка белков K (v) LQT1 и minK (IsK) с образованием сердечного калиевого канала I-Ks. Природа 384 , 80–83 (1996).
КАС пабмед Google ученый
Hedley, P.L. et al. Генетическая основа синдромов удлиненного интервала QT и короткого интервала QT: обновление мутации. Гул. Мутат. 30 , 1486–1511 (2009).
КАС пабмед Google ученый
Сплавски И., Тимоти К.В., Винсент Г.М., Аткинсон Д.Л. и Китинг М.Т. Молекулярная основа синдрома удлиненного интервала QT, связанного с глухотой. Н. англ. Дж. Мед. 336 , 1562–1567 (1997).
КАС пабмед Google ученый
Wang, Q. et al. Позиционное клонирование нового гена калиевого канала: мутации KVLQT1 вызывают сердечные аритмии. Нац. Genet 12 , 17–23 (1996).
ПабМед Google ученый
Holmkvist, J. et al. Ассоциированный с диабетом 2 типа минорный аллель rs2237895 KCNQ1 ассоциируется со сниженным высвобождением инсулина после пероральной нагрузки глюкозой. PloS ONE 4 , e5872 (2009 г.).
«>Саиф-Али Р. и др. Гаплотипы KCNQ1 связаны с диабетом 2 типа у малайзийских китайцев. Междунар. Дж. Мол. науч. 12 , 5705–5718 (2011).
КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый
Саиф-Али Р. и др. Варианты KCNQ1 связаны с диабетом 2 типа у малайзийских малайцев. Энн. акад. Мед. Сингапур. 40 , 488–492 (2011).
ПабМед Google ученый
Уноки Х. и др. SNP в KCNQ1 связаны с предрасположенностью к диабету 2 типа в популяциях Восточной Азии и Европы. Нац. Жене. 40 , 1098–1102 (2008).
КАС пабмед Google ученый
Хоу, П. П. и др. Инактивация калиевых каналов KCNQ1 выявляет динамическую связь между определением напряжения и открытием пор. Нац Коммуна 8 , 1730 (2017).
Пуш М., Маграси Р., Воллник Б. и Конти Ф. Активация и инактивация гомомерных калиевых каналов KvLQT1. Биофиз. J. 75 , 785–792 (1998).
КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый
Tristani-Firouzi, M. & Sanguinetti, M.C. Зависимая от напряжения инактивация человеческого K+-канала KvLQT1 устраняется путем ассоциации с минимальными субъединицами K+-канала (minK). J. Physiol. 510 , 37–45 (1998).
КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый
«>Сюй, X. и др. Увеличение I(Ks) корректирует аномальную реполяризацию в моделях кроликов с приобретенным LQT2 и гипертрофией желудочков. утра. Дж. Физиол. Цирк Сердца. Физиол. 283 , H664–H670 (2002 г.).
КАС пабмед Google ученый
Seebohm, G., Pusch, M., Chen, J. & Sanguinetti, M.C. Фармакологическая активация нормальных и связанных с аритмией мутантных калиевых каналов KCNQ1. Обр. Рез. 93 , 941–947 (2003).
КАС пабмед Google ученый
Пуш, М. Увеличение одноканальной проводимости калиевых каналов KvLQT1, вызванное ассоциацией с minK. Пфлюг. Арка 437 , 172–174 (1998).
КАС Google ученый
Seebohm, G., Lerche, C., Busch, A.E. & Bachmann, A. Зависимость биофизических свойств I(Ks) от системы экспрессии. Пфлюг. Арка 442 , 891–895 (2001).
КАС Google ученый
Seebohm, G., Sanguinetti, M.C. & Push, M. Тесная связь проводимости и инактивации рубидия в калиевых каналах KCNQ1 человека. J. Physiol. 552 , 369–378 (2003).
КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый
Сести, Ф. и Гольдштейн, С. А. Одноканальные характеристики каналов IKs дикого типа и каналов, образованных двумя мутантами minK, которые вызывают синдром удлиненного интервала QT. J. Gen. Physiol. 112 , 651–663 (1998).
КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый
«>Ларсен А. П., Штеффенсен А. Б., Груннет М. и Олесен С. П. Внеклеточный калий ингибирует калиевые каналы Kv7.1, стабилизируя инактивированное состояние. Биофиз. J. 101 , 818–827 (2011).
КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый
Osteen, J.D. et al. KCNE1 изменяет движения датчика напряжения, необходимые для открытия затвора канала KCNQ1. Проц. Натл акад. науч. США 107 , 22710–22715 (2010 г.).
КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый
«>Лонг С. Б., Кэмпбелл Э. Б. и Маккиннон Р. Датчик напряжения Кв1.2: конструктивная основа электромеханической муфты. Наука 309 , 903–908 (2005).
КАС пабмед Google ученый
Sun, J. & MacKinnon, R. Структурная основа модуляции и гейтирования KCNQ1 человека. Сотовый 180 , 340-+ (2020).
КАС пабмед Google ученый
Catacuzzeno, L., Sforna, L. & Franciolini, F. Зависимое от напряжения стробирование в K-каналах: экспериментальные результаты и количественные модели. Пфлюг. Арх.: Евро. Дж. Физиол. 472 , 27–47 (2020).
КАС Google ученый
Ye, S. et al. Сайт-специфическое включение кето-аминокислот в функциональные рецепторы, связанные с G-белком, с использованием неестественного мутагенеза аминокислот. J. Biol. хим. 283 , 1525–1533 (2008).
КАС пабмед Google ученый
Gibor, G. et al. Ворота инактивации в фильтре селективности калиевых каналов KCNQ1. Биофиз. J. 93 , 4159–4172 (2007).
КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый
Хоу, П. и др. Двухступенчатая электромеханическая связь канала K-V при активации, зависящей от напряжения. Нац Коммуна 11 , 676 (2020).
Kuenze, G. et al. Модернизированные молекулярные модели калиевого канала KCNQ1 человека. PloS ONE 14 , e0220415 (2019).
КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый
Henrion, U., Strutz-Seebohm, N., Duszenko, M., Lang, F. & Seebohm, G. Мутации, связанные с синдромом удлиненного интервала QT, в датчике напряжения I(Ks) каналов. Клеточная физиол. Биохим. 24 , 11–16 (2009).
КАС пабмед Google ученый
Huang, H. et al. Механизмы дисфункции канала KCNQ1 при синдроме удлиненного интервала QT, включающем мутации сенсорного домена напряжения. Науч. Доп. 4 , eaar2631 (2018).
ПабМед ПабМед Центральный Google ученый
Sanguinetti, M.C. & Jurkiewicz, N.K. Два компонента сердечного выпрямителя K+ тока. Дифференциальная чувствительность к блокаде антиаритмическими средствами III класса. J. Gen. Physiol. 96 , 195–215 (1990).
КАС пабмед Google ученый
Seebohm, G., Westenskow, P., Lang, F. & Sanguinetti, M.C. Мутации колокализованных остатков поровой спирали и трансмембранных сегментов S5 и S6 нарушают дезактивацию и модифицируют инактивацию K+ каналов KCNQ1. J. Physiol. 563 , 359–368 (2005).
КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый
Sun, J. & MacKinnon, R. Крио-ЭМ-структура комплекса KCNQ1/CaM дает представление о врожденном синдроме удлиненного интервала QT. Сотовый 169 , 1042-+ (2017).
КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый
Seebohm, G. et al. Дифференциальные роли шарниров домена S6 в управлении калиевыми каналами KCNQ. Биофиз. J. 90 , 2235–2244 (2006).
КАС пабмед Google ученый
Redford, K.E. & Abbott, G.W. Вездесущий флавоноид кверцетин является атипичным KCNQ активатором калиевых каналов. Комм. биол. 3 , 356 (2020).
КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый
Дилгер Дж. М., Гловер М. С. и Клеммер Д. Э. База данных поперечных сечений пептидов, координируемых переходными металлами: селективное взаимодействие со специфическими аминокислотными остатками. Дж. Ам. соц. Масс-спектр. 28 , 1293–1303 (2017).
КАС пабмед Google ученый
MacColl, R. et al. Взаимосвязь между биологической активностью, дисульфидными связями, вторичной структурой и связыванием ионов металлов для химически синтезированного 34-аминокислотного пептида, полученного из альфа-фетопротеина. Бба-Ген. Сабж. 1528 , 127–134 (2001).
КАС Google ученый
Sovago, I., Kiss, T., Varnagy, K. & Reverend, B.D. Комплексы кобальта(Ii) и цинка(Ii) цистеинсодержащих дипептидов. Многогранник 7 , 1089–1093 (1988).
КАС Google ученый
вещества
Полнотекстовые ссылки
Эльзевир Наука
Укажите
Формат: ААД АПА МДА НЛМ
Отправить по номеру
Бензодиазепиновый активатор блокирует каналы Kv 7.
1, открываемые электромеханической развязкой. 2022 1 апреля; 5 (1): 301.
doi: 10.1038/s42003-022-03229-8.
Джулиан А. Шрайбер # 1 2 , Мелина Мёллер # 1 , Марк Зайдман 3 , Лу Чжао 3 , Закари Беллер 3 , Себастьян Беккер 1 , Надин Риттер 1 4 , Панпан Хоу 3 , Цзиньи Ши 3 , Джон Сильва 3 , Ева Врубель 1 , Натали Штрутц-Сибом 1 , Нильс Дешер 5 , Николь Шмитт 6 , Свен Дж. Мейт 7 , Мартина Дюфер 2 4 , Бернхард Вюнш 2 4 , Цзяньминь Цуй 3 , Гвискар Сибом 8 9
Принадлежности
# Внесли поровну.
Бесплатная статья ЧВК
Джулиан А. Шрайбер и соавт. коммун биол. .
Бесплатная статья ЧВК
. 2022 1 апреля; 5 (1): 301.
doi: 10.1038/s42003-022-03229-8.
Авторы
Джулиан А. Шрайбер # 1 2 , Мелина Мёллер # 1 , Марк Зайдман 3 , Лу Чжао 3 , Закари Беллер 3 , Себастьян Беккер 1 , Надин Риттер 1 4 , Панпан Хоу 3 , Цзиньи Ши 3 , Джон Сильва 3 , Ева Врубель 1 , Натали Штрутц-Сибом 1 , Нильс Дешер 5 , Николь Шмитт 6 , Свен Дж. Мейт 7 , Мартина Дюфер 2 4 , Бернхард Вюнш 2 4 , Цзяньминь Цуй 3 , Гвискар Сибом 8 9
Принадлежности
# Внесли поровну.
Абстрактный
Мутации с потерей функции в K v 7.1 часто приводят к синдрому удлиненного интервала QT (LQTS), нарушению сердечной реполяризации, связанному с аритмией и последующей внезапной сердечной смертью. Открытие агониста I 9Модуляторы 0823 Ks могут предложить новую потенциальную стратегию фармакологического лечения этого расстройства. Производное бензодиазепина (R)-L3 сильно активирует каналы K v 7.1 и сокращает продолжительность потенциала действия, поэтому может служить отправной точкой для разработки лекарств. Однако молекулярные механизмы, лежащие в основе модуляции (R)-L3, до сих пор неизвестны. Комбинируя аланиновый сканирующий мутагенез, включение неканонических аминокислот, электрофизиологию с фиксацией напряжения и флуорометрию, а также моделирование белков на кремнии, мы показываем, что (R)-L3 не только стимулирует токи за счет аллостерической модуляции порового домена, но также изменяет кинетику. независимо от эффектов порового домена. Мы идентифицируем новые (R)-L3-взаимодействующие ключевые остатки в нижнем S4-сегменте K v 7.1 и наблюдал разъединение внешнего сегмента S4 с внутренними сегментами S5, S6 и селективного фильтра.
© 2022. Автор(ы).
Заявление о конфликте интересов
Авторы заявляют о следующих конкурирующих интересах: J.i.S. и Джей Си являются соучредителями стартапа VivoCor LLC, который нацелен на ИК для лечения сердечной аритмии. Другие авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Цифры
Рис. 1. ( R )-L3 активирует и…
Рис. 1. ( R )-L3 активирует и замедляет скорость активации и деактивации…
a Химическая структура ( R )-L3. b Последовательности импульсов для экспериментов по фиксации напряжения. c Влияние 1 мкМ ( R )-L3 на токи hK v 7.1, зарегистрированные в ооците с помощью 7-секундного импульса до потенциалов от -100 мВ до +60 мВ от удерживающего потенциала -80 мВ . Токи регистрировали в контрольном растворе, содержащем 0,1% ДМСО, с последующей перфузией 1 мкМ ( R )-L3, содержащий раствор. d Кривая доза-реакция для ( R )-L3 из hK v 7.1, экспрессирующих ооциты при испытательном напряжении +40 мВ. Каждая концентрация применялась к четырем независимым ооцитам ( n = 20) e Зависимость активации тока от напряжения в отсутствие (черный; n = 13) и в присутствии ( R )-L3 (серый; n = 15), определяемый по пиковым хвостовым токам, измеренным при −120 мВ. Токи были нормированы на пиковые хвостовые токи, возникающие после импульса до +40 мВ. f – i Кинетика оценивалась как при отсутствии (черный; Ctrl), так и при наличии (серый; +( R )-L3) 1 мкМ ( R )-L3 и аппроксимировалась двухкомпонентной экспоненциальной зависимостью. функция. Константы времени рассчитаны для отдельных ооцитов и даны для быстрых ( f ; n = 9 для обоих условий) и для медленных ( g ; n = 9 для ctrl, n = 9 R )-L3) компонента K v 7.1 активации, а также для быстрой ( ч ; N = 8 для Ctrl, N = 6 для+( R ) -L3) и для медленного ( I ; N = 7 для CTRL, N = 8 для+(434444444444444444444444444444444444444444444444444. )-L3)) компонент K v 7.1 деактивация. Значимость средних различий анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа и апостериорного сравнения среднего по критерию Тьюки (* p < 0,05, *** p < 0,001).
Рис. 2. Влияние ( Р )-Л3…
Рис. 2. Влияние ( R )-L3 на hK v 7.1 in high K +…
и ,…
Рис. 2. Влияние ( R )-L3 на hK v 7.1 в буфере с высоким содержанием K + и Rb + .a , b Типичные следы тока в 100 мМ K + ( a ) и 100 мМ Rb + ( b ) до (черный; ctrl) и после (серый; +( R )-L3) добавления 1 мкМ ( R )- Л3. c Активация токов канала hK v 7.1 на 1 мкМ ( R )-L3, выраженная в процентах изменения тока при высоких K + и Rb + ( n 902 + 9026 + 903 K 18 = 903 K = , n = 17 для Rb + ) по сравнению с активацией, измеренной в ND96 ( n = 30). Значимость средних различий оценивали с помощью однофакторного ANOVA и апостериорного теста сравнения средних Тьюки (ns для p > 0,05, * p < 0,05). d , e Вольт-амперная зависимость для hK v 7.1, экспрессирующих ооциты в отсутствие (черный, n = 18 для K + и Rb + 3 n, 4 0 8 3 8 y , 90) 17 для K + , n = 18 для Rb + ) из 1 мкМ ( R )-L3 в 100 мМ K + ( d ) и 100 мМ Rb + ( e ). В 1/2 Значения были определены из нормированных пиковых хвостовых токов при -120 мВ для каждого ооцита и подогнаны под уравнение Больцмана. F , G Медленная деактивационная компонент HK V 7,1 в High K + ( F ) и высокий RB + ( G ) в ABSED; K + , n = 18 для Rb + ) и присутствие (серый; n = 9 для K + и n = 18 для Rb + ) ( R )-L3. Постоянные времени τ slow deact определяли с помощью двухкомпонентной экспоненциальной аппроксимации для каждого ооцита и шага напряжения. h Изображение KCNQ1 в активированном состоянии (AO, получено из Kuenze et al. Аминокислоты, имеющие решающее значение для активности ( R )-L3 (пурпурный цвет), расположены в нижней части спирали S5 (зеленый) и S6 (синий). Большинство боковые цепи важнейших аминокислот ориентированы на линкер S4S5 (оранжевый) и VSD (желтый) соседней субъединицы KCNQ1.
Рис. 3. ( R )-L3 потенциирует К…
Рис. 3. ( R )-L3 потенцирует K v 7.1 VCF (C214A/G219C/C331A) токи и сдвиги влево…
a Токи целых клеток из ооцита, экспрессирующего K v 7.1 VCF , меченного малеимидом Alexa 488 C5. Каждые 15 с напряжение на мембране пульсировало от потенциала покоя -80 мВ до +60 мВ в течение 4 с, за которым следовали 2-секундные хвосты при -40 мВ. Токи до (черный) и после (красный) введения болюса ( R )-L3 в ванну (конечная концентрация ~10 мкМ). b Установившийся ток при +60 мВ в зависимости от времени во время применения ( R )-L3 (обозначен красной полосой). Черная линия представляет собой среднее значение, серые точки представляют необработанные данные каждого измерения ( n = 4). c Импульсный протокол для одновременной регистрации тока и флуоресценции в ( d — g ). d Образец текущей кривой от одного ооцита до (черный) и после (красный) воздействия ~ 10 мкМ ( R )-L3. и G / G max отношение напряжения K v 7,1 VCF , экспрессирующие ооциты в отсутствие (черный) и в присутствии (красный) ( R )-L3 ( n = 4 для обоих условий). f Образец флуоресценции ооцита до (черный) и после (красный) воздействия ~ 10 мкМ ( R )-L3. g Соотношение напряжения dF/F для K и 7,1 VCF , экспрессирующих ооциты в отсутствие (черный) и в присутствии (красный) ( R )-L3 ( n = 4 для обоих условий).
Рис. 4. Чувствительность остатков S4 к…
Рис. 4. Чувствительность остатков S4 к модуляции ( R )-L3.
a – d Репрезентативные трассы тока…
Рис. 4. Чувствительность остатков S4 к модуляции ( R )-L3.a – d Репрезентативные текущие следы дикого типа ( a ) и мутантные каналы L236A ( b ), R237A ( c ) и h340 ( d ). e Активация амплитуды тока мутантов канала K v 7.1 с помощью 1 мкМ ( R )-L3, выраженная в процентах изменения тока, измеренного в конце 7-секундного импульса, до +40 мВ ( n = 30 Для WT, N = 13 для I235A, N = 18 для L236A, N = 12 для R237A, N = 18 для M238A, N = 13 на L239A, N = 13 на L239A, N = 13.0843 n = 12 для h340A, n = 16 для V241A). Значимость средних различий оценивали с помощью однофакторного ANOVA и апостериорного сравнения среднего по критерию Тьюки (* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001). f – i Влияние ( R )-L3 на скорость активации и деактивации мутантных каналов hK v 7.1. Кинетику оценивали как в отсутствие, так и в присутствии 1 мкМ ( R )-L3 и аппроксимировали двухкомпонентной экспоненциальной функцией (количество независимых ооцитов для ( f – i ) приведены в таблице SI 3).
Рис. 5. Фотосшивание фотоактивируемого неканонического…
Рис. 5. Фотосшивание фотоактивируемой неканонической аминокислоты AzF приводит к образованию мультимеров.
a , b Используя метод подавления янтаря для включения неканонических аминокислот (ncAA), мы ввели фотоактивируемую неканоническую аминокислоту AzF ( b ) в положение M238 в мутант K v 7.1-EGFP-M238AMBER-Стоп. Клетки HEK котрансфицировали кДНК, кодирующей K v 7.1-EGFP-M238amber-Stop, супрессорную тРНК и синтетазу AzF-тРНК. Добавление ncAA p -азидофенилаланина (AzF) в концентрации 0,5 мМ к среде для культивирования клеток позволило включить ncAA. c I274 взаимодействует с M238 соседней субъединицы в активированном состоянии in silico . d Успешное включение и экспрессию полноразмерного белка оценивали с помощью конфокальной визуализации EGFP. e K v Клетки HEK, экспрессирующие 7.1-EGFP-M238AzF, инкубировали в растворах с высоким содержанием K + (137 мМ KCl), что приводило к образованию каналов преимущественно в деполяризованном (вычисленное V m около -8,9 мВ) состояниях. УФ-облучение вызывало образование мультимеров при высоких K + / преимущественно деполяризующие условия, соответствующие предсказанному взаимодействию. f Нормализованные токи hK v 7,1 WT и hK v 7,1 M238C/I274C, экспрессирующие ооциты в отсутствие и в присутствии ( R )-L3 и Co 2+ ионов (количество ооцитов для каждого состояния см. Таблицу SI 2).
Рис. 6. Локализация сайта связывания и в…
Рис. 6. Локализация сайта связывания и результаты моделирования in silico .
a Изображение тетрамера KCNQ1…
Рис. 6. Локализация сайта связывания и результаты моделирования in silico .a Изображение тетрамерной модели АО KCNQ1 с субъединицами, окрашенными в пурпурный (Mol A), желтый (Mol B), зеленый (Mol C) и синий (Mol D). Предлагаемый сайт связывания ( R )-L3 отмечен красным квадратом. b Крупный план сайта связывания ( R )-L3 (CPK-цвет, кодированный голубым для углерода) с S4 (желтый) и линкером S4S5 (оранжевый) из субъединицы Mol B и спирали S5 и S6 (пурпурный) из субъединицы Mol A. Ранее проанализированные аминокислоты из S5 и S6, влияющие на активность ( R )-L3, окрашены в фиолетовый цвет, тогда как вновь проанализированные остатки из линкера S4 и S4S5 окрашены в зеленый или фиолетовый цвет. c Схематическое изображение ( R )-L3 сайт связывания между линкером S4 (желтый) и линкером S4S5 (оранжевый) из субъединицы Mol B и S5 и S6 (розовый) из субъединицы Mol A. d Изображение модели АО KCNQ1, встроенной в мембрану для моделирования МД. Субъединицы Mol A-D окрашены, как на 5А, а сайт связывания ( R )-L3 отмечен красным квадратом. e Среднеквадратичное отклонение (RMSD) 30 нс MD-моделирования для полных смоделированных структур AO (n = 5 симуляций), AC ( n = 3) и RC ( n = 3) с ( R )-L3 для каждой симуляции. Средние значения показаны в виде столбцов и не имеют существенных различий, обозначенных ns. f RMSD движения лиганда ( R )-L3 от начала до конца 30 нс MD моделирования состояний KCNQ AO ( n = 5), AC ( n = 3) и RC ( n = 3). g ( R )-L3 Среднеквадратичная флуктуация (RMSF) для 30 нс МД моделирования с моделями состояния KCNQ1 AO ( n = 5), AC ( n = 3) и RC ( n = 3). Средние различия недостоверны (ns; p > 0,05). ч Энергия связи [кДж/моль] ( R )-L3 рассчитана для всех моментальных снимков симуляции от 10 до 30 нс МД моделирования для моделей KCNQ1 AO ( n = 405 снимков), AC ( n = 243) и RC ( n = 243). i Длительность гидрофобного взаимодействия между ( R )-L3 и мутантными аминокислотами из линкера S4 и S4S5 в процентах от общего времени моделирования MD 30 нс для моделирования АО ( n = 5). j , k RMSD и RMSF основной цепи мутантных остатков в отсутствие ( n = 3 моделирования)/наличии ( n = 5 моделирования) ( R )-L3. l активность 1 мкМ ( R )-L3 в ооцитах дикого типа, экспрессирующих KCNQ1, по сравнению с мутациями W248F, W248A и W248R ( n = 4 для WT, n = 4 для WT, n 2485, для W2485, и W2485, для W2485) .
Рис. 7. Динамические кросс-корреляционные матрицы (DCCM) для…
Рис. 7. Динамические кросс-корреляционные матрицы (DCCM) для взаимодействий между VSD (линкер S4, S4S5) и PD…
a ( R )-L3 (цветовой код CPK с голубым для углерода) сайт связывания между субъединицами Mol A и B с взаимодействующими вторичными структурами S4 (Mol B, желтый), линкер S4S5 (Mol B, оранжевый), S5 (Mol A, зеленый), S6 (Mol A, синий) и селективный фильтр (Mol A, фиолетовый). Первая и последняя аминокислоты всех вторичных структур показаны одним цветом. b , c Динамическая кросс-корреляционная матрица (DCCM) для S4 (Mol B, желтый) и линкера S4S5 (Mol B, оранжевый) в отсутствие ( b ) и в присутствии ( c ) () R )-L3 от -1 (полностью антикоррелирован) выше 0 (не коррелирован) до 1 (полностью коррелирован). d Увеличение (положительные значения, красный цвет) и уменьшение (отрицательные значения, синий цвет) корреляции между линкерными остатками S4 и S4S5 в зависимости от присутствия ( R )-L3. е , е DCCM для S4 (Mol B, желтый) и S5 (Mol A, зеленый) в отсутствие ( e )/присутствии ( f ) ( R )-L3. г Увеличение (положительные значения, красный цвет) и уменьшение (отрицательные значения, синий цвет) корреляции между остатками S4 и S5 в зависимости от присутствия ( R )-L3. h , i DCCM для S4 (Mol B, желтый) и S6 (Mol A, синий) в отсутствие ( h )/присутствии ( i ) ( R )-L3. j Увеличение (положительные значения, красный) и уменьшение (отрицательные значения, синий) корреляции между остатками S4 и S6 в зависимости от присутствия ( Р )-L3. Все данные на рис. 7 получены из 5 независимых симуляций в присутствии и 3 независимых симуляций в отсутствие ( R )-L3.
Рис. 8. Динамические кросс-корреляционные матрицы (DCCM) для…
Рис. 8. Динамические кросс-корреляционные матрицы (DCCM) для взаимодействий между поровой спиралью и S4-S6.
a Крупный план…
Рис. 8. Динамические кросс-корреляционные матрицы (DCCM) для взаимодействий между поровой спиралью и S4-S6.a Крупный план сайта связывания ( R )-L3 с S4 (желтый), линкером S4S5 (оранжевый), S5 (зеленый), S6 (синий) и селективным фильтром (фиолетовый) со всеми аминокислотами из от V310 до P320. b , c СКО селективности Остатки фильтра V310 – P320 по отдельности ( b ) и в сумме ( c ) при отсутствии (черный) и наличии (красный) ( R )-L3. Средние значения даны в виде квадратов ( b ) или столбцов ( c ). ( d , e ) Динамическая кросс-корреляционная матрица (DCCM) для S4 (Mol B, желтый) и фильтра селективности (Mol A, фиолетовый) в отсутствие ( d ) и присутствии ( e ) ( R )-L3 от -1 (полностью антикоррелированный) выше 0 (не коррелированный) до 1 (полностью коррелированный). f Увеличение (положительные значения, красный цвет) и уменьшение (отрицательные значения, синий цвет) корреляции между S4 и остатками селективного фильтра в зависимости от присутствия ( Р )-L3. г , ч DCCM для линкера S4S5 (Mol B, оранжевый) и селективного фильтра (Mol A, фиолетовый) в отсутствие ( г )/присутствии ( ч ) ( R )-L3. ( i ) Увеличение (положительные значения, красный цвет) и уменьшение (отрицательные значения, синий цвет) корреляции между линкером S4S5 и остатками фильтра селективности в зависимости от присутствия ( R )-L3. j , k DCCM для S5 (Mol A, зеленый) и селективного фильтра (Mol A, фиолетовый) в отсутствие ( j )/наличие ( k ) из ( R )-L3. l Увеличение (положительные значения, красный цвет) и уменьшение (отрицательные значения, синий цвет) корреляции между S5 и остатками селективного фильтра в зависимости от присутствия ( R )-L3. m , n DCCM для S6 (Mol A, синий) и селективный фильтр (Mol A, фиолетовый) в отсутствие ( m )/присутствии ( n ) ( R )-L3. o Увеличение (положительные значения, красный цвет) и уменьшение (отрицательные значения, синий цвет) корреляции между S6 и остатками селективного фильтра в зависимости от присутствия ( Р )-L3. Все данные на рис. 8 получены из 5 независимых симуляций в присутствии и 3 независимых симуляций в отсутствие ( R )-L3.
См. это изображение и информацию об авторских правах в PMC
Похожие статьи
Посмотреть все похожие статьи
Цитируется
использованная литература
Типы публикаций
термины MeSH
вещества
Грантовая поддержка
Бензодиазепиновый активатор блокирует открытие каналов Kv7.
1 путем электромеханического размыканияВведение
K v 7.1 каналы являются основателями потенциалзависимых K v 7 калиевых каналов замедленного выпрямления (K v ), которые играют важную роль в различных тканях, включая эпителий, мозг, сердце и органы внутреннего уха 1,2 . В нативных тканях α-субъединицы K v 7.1 (кодируемые KCNQ1 ) могут взаимодействовать с различными вспомогательными субъединицами или модуляторными белками, которые составляют биофизические свойства канала, продуцирующего функционально различные K + -токи 3,4,5,6,7 . В сердечных миоцитах совместная сборка порообразующей α-субъединицы и ее регуляторной β-субъединицы KCNE1 (норка, IsK) генерирует критический для реполяризации медленный компонент калиевого тока замедленного выпрямления сердца I Ks потенциала действия сердца 8,9 . Мутации с потерей функции в K v 7. 1 могут приводить к длительной реполяризации сердца и вызывать синдром удлиненного интервала QT (LQTS), генетически гетерогенную сердечную аритмию, характеризующуюся удлиненной фазой реполяризации 9 желудочков.0325 10,11,12 . Недавно диабет был связан с KCNQ1 , а также с 13,14,15,16,17 . Кроме того, каналы K v 7.1 важны во многих других органах и способствуют различным физиологическим функциям 1,2,4 . Таким образом, 7.1-канальные модуляторы K v обладают потенциалом для разработки новых фармакологических стратегий лечения многих заболеваний, таких как сердечные аритмии, диабет, диарея, нарушение функции щитовидной железы и другие.
Гомомерные каналы K v 7.1 проявляют активацию при деполяризации мембраны и частично инактивируются с задержкой. Эта отсроченная медленная инактивация не может наблюдаться непосредственно при активации канала, но становится заметной, когда мембрана переходит к гиперполяризованным потенциалам после длительной (ин)активации канала, и каналы переключаются из инактивированного состояния в активированное перед закрытием. Таким образом, на текущих следах виден характерный крючок на хвосте. Было предложено, чтобы эти характеристики стробирования Kv7.1 были результатом как минимум двух открытых состояний, которые должны быть заняты во время процесса стробирования, из которых канал может переходить в состояния мерцания с несколькими субпроводящими состояниями 18,19,20 .
Прототипом сильнодействующего активатора K v 7.1 является производное бензодиазепина ( R )-L3 (L-364,373), которое приводит к увеличению амплитуды тока I Ks , сокращает продолжительность потенциала действия у морских свинок сердечных миоцитов и подавляет раннюю постдеполяризацию в желудочковых миоцитах кролика 21,22 . Канальная модуляция K v 7.1 с помощью ( R )-L3 связана с выраженными изменениями параметров стробирования 21,23 . ( R )-L3, по-видимому, блокирует канал в закрытом и открытом состояниях и, следовательно, предотвращает переход канала в неактивное состояние, что заметно по отсутствию крючка в хвостовых токах 23 . Таким образом, присутствие ( R )-L3, по-видимому, уменьшает или устраняет конкретный переход отпирания к субпроводящим состояниям. β-субъединица KCNE1 увеличивает проводимость канала, замедляет активацию и деактивацию канала, а также заметно снижает макроскопическую инактивацию 8,9,19,24,25,26,27 . Таким образом, ( R )-L3 и KCNE1 вызывают несколько схожие эффекты на канал K v 7.1.
Учитывая терапевтический потенциал ( R )-L3-подобных соединений, существует большой интерес к определению сайта связывания соединения и пониманию его молекулярного механизма действия. Предыдущие данные показали, что специфические остатки в поровом домене K v 7.1 взаимодействуют с ( R )-L3, позволяя соединению замедлять кинетику канала K v 7.1 и увеличивать ток ионного канала 23 . Однако точный молекулярный механизм модуляции каналов оставался неясным. Некоторые из ранее идентифицированных аминокислот, оказывающих сильное влияние на активность ( R )-L3, расположены на границе раздела между датчиком напряжения и поровым доменом. Т.о., это исследование показывает, что вольтаж-сенсорный домен (VSD) может быть важной структурной мишенью для разработки специфических агонистов Kv7-каналов -28-.
Мы предположили, что поскольку ( R )-L3 изменяет кинетику активации и деактивации и зависимость K 9 от напряжения0823 v 7.1 активация, ( R )-L3 также может физически взаимодействовать с VSD. Чтобы ответить на этот вопрос, мы систематически исследовали нижний сегмент S4 K v 7.1 с помощью сайт-направленного мутагенеза и впоследствии проанализировали параметры мутировавших каналов в отсутствие и в присутствии ( R )-L3. Чтобы получить представление о молекулярном механизме действия, мы выполнили 3D-моделирование K v 7.1 и ( R )-L3, управляемое экспериментальными данными, для определения полного сайта связывания. Последующее моделирование молекулярной динамики было использовано для оценки стабильности связывания лекарственного средства и изучения режима связывания лекарственного средства.
Результаты
(
R )-L3 активирует каналы hK v 7.1, выраженные в ооцитах Xenopusсайт связывания с VSD в экспериментах с двумя электродами с зажимом напряжения с использованием hK v 7.1, экспрессирующих ооциты Xenopus laevis (рис. 1b, c). В соответствии с нашими предыдущими электрофизиологическими исследованиями мы обнаружили устойчивый агонизм K v 7.1 с помощью ( R )-L3 23 , который характеризуется значением ЕС 50 4,2 ± 3,5 мкМ ( n = 20; SE) и максимальной активацией на 212 ± 55% (SE, рис. . В соответствии с нашими предыдущими данными, ( R )-L3 сдвигает зависимую от напряжения активацию от −20 ± 1 мВ (SE) до −28 ± 1 мВ для V 1/2 (SE, рис. 1e ). Более выраженные изменения можно наблюдать для кинетики активации и дезактивации (рис. 1f-i). 1 мкМ ( R )-L3 увеличивает константы времени для быстрой активации (τ быстрое действие. ), а также для компонентов медленной дезактивации (τ slow deact. ), приводящих к замедленной активации и деактивации канала.
Рис. 1: ( R )-L3 активирует и замедляет скорость активации и дезактивации каналов hK v 7.1, экспрессированных в ооцитах Xenopus .a Химическая структура ( R )-L3. b Последовательности импульсов для экспериментов по фиксации напряжения. c Эффект 1 мкМ ( R )-L3 on hK v 7.1 токи, регистрируемые в ооците 7-секундным импульсом до потенциалов от -100 мВ до +60 мВ от удерживающего потенциала -80 мВ. Токи регистрировали в контрольном растворе, содержащем 0,1% ДМСО, с последующей перфузией раствором, содержащим 1 мкМ ( R )-L3. d Кривая доза-реакция для ( R )-L3 из hK v 7.1, экспрессирующих ооциты при испытательном напряжении +40 мВ. Каждая концентрация применялась к четырем независимым ооцитам ( n = 20) e Зависимость активации тока от напряжения в отсутствие (черный; n = 13) и в присутствии ( R )-L3 (серый; n = 15), определенная по пиковым хвостовым токам, измеренным при –120 мВ. Токи были нормированы на пиковые хвостовые токи, возникающие после импульса до +40 мВ. f – i Кинетика оценивалась как при отсутствии (черный; Ctrl), так и при наличии (серый; +( R )-L3) 1 мкМ ( R )-L3 и аппроксимировалась двухкомпонентной экспоненциальной зависимостью. функция. Постоянные времени рассчитаны для отдельных ооцитов и приведены для быстрых ( ф ; n = 9 для обоих условий) и для медленного ( g ; n = 9 для ctrl, n = 8 для + ( R v4.7042 )-L08 активация скважины как L03) компонента Что касается Fast ( H ; N = 8 для Ctrl, N = 6 для+( R ) -L3) и для медленного ( I ; N = 7 для Ctrl, N 43 N = 7 для CTRL, N 3 N = 7 для CTRL, N 3 N = 7 для Ctr = 8 для + ( R )-L3)) компонента деактивации K v 7.1. Значимость средних различий анализировали с помощью одностороннего дисперсионного анализа и апостериорного сравнения средних значений по критерию Тьюки (* p < 0,05, *** p < 0,001).
Изображение полного размера
(
R )-L3 Активационные свойства зависят от ионного составаНаблюдаемые эффекты ( R )-L3 являются результатом прямого взаимодействия с каналом K v 7.1. Чтобы определить, являются ли наблюдаемые эффекты результатом прямого взаимодействия с поровым доменом (PD), мы проверили, может ли изменение проникающего иона влиять на модулирующие свойства ( R )-L3. Поэтому мы проводили записи с использованием 1 мкМ ( R )-L3 со 100 мМ K + и 100 мМ Rb + , содержащими буферы (рис. 2а, б). Интересно, что активация скорректированной (внутренней) амплитуды хвостового тока была немного, но не значительно снижена в высоком Rb + (42 ± 5%, SEM, n = 18) по сравнению с K + (54 ± 8%, РЭМ, n = 17, рис. 2в). Хотя прямое сравнение эффектов затруднено, так как внешний K + влияет на начало инактивации канала 29, активация скорректированной амплитуды хвостового тока в ND96 (96 Na + /4 мМ K + ) значительно больше (84 ± 7%, SEM, n = 30). Ранее наблюдаемый сдвиг V 1/2 в присутствии ( R )-L3 в ND96 ослабляется в высоких K + /Rb + (рис. 2г, д). В 100 мМ K + буфере V 1/2 сдвигается от –30 ± 1 мВ (SE) до –31 ± 1 мВ (SE) в присутствии ( R )-L3, в то время как V 1/2 в 100 мМ Rb + снижается с –42 ± 1 мВ (SE) до –47 ± 2 мВ (SE). С другой стороны, модуляция кинетики быстрой и медленной дезактивации в присутствии ( R )-L3 в буферах с высоким содержанием K + /Rb + подобна наблюдаемой модуляции в ND96, что приводит к незатронутой быстрой и повышенной постоянные времени медленной дезактивации (рис. 2f, g, SI рис. 1). Суммируя эти результаты, можно сказать, что эффекты ( R )-L3 модулируются различными видами внешних ионов, что подразумевает прямое воздействие на область пор. Более того, результаты в соответствии с нашим предыдущим исследованием выявили несколько остатков из порообразующих спиралей S5 и S6, которые значительно снижают эффективность ( R )-L3 (рис. 2h) 23 . В совокупности эффекты ( R )-L3 частично зависят от прямого влияния на поровую область.
Рис. 2: Влияние ( R )-L3 на hK v 7,1 в буфере с высоким содержанием K + и Rb + . A , B Репрезентативные следы тока в 100 мМ K + ( A ) и 100 мм RB + ( B ) до (черный; Ctrl) и ATHERSH ( B ) до (CTR; Ctrl) и ATHTER ( B ) (CTR; Ctrl) и ATHTER ( B ) ( B ) ( B ) ( B ); р )-L3) добавление 1 мкМ ( R )-L3. c Активация токов канала hK v 7.1 на 1 мкМ ( R )-L3, выраженная в процентах изменения тока при высоких K + и Rb + ( n 902 + 9026 + 903 K 18 = 903 K = , n = 17 для Rb + ) по сравнению с активацией, измеренной в ND96 ( n = 30). Значимость средних различий оценивали с помощью однофакторного ANOVA и теста Тьюки для сравнения апостериорных средних (ns для p > 0,05, * p < 0,05). d , e Вольт-амперная зависимость для hK v 7.1, экспрессирующих ооциты в отсутствие (черный, n = 18 для K + и Rb + 3 n, 4 0 8 3 8 y , 90) 17 for K + , n = 18 for Rb + ) of 1 µM ( R )-L3 in 100 mM K + ( d ) and 100 mM Rb + ( e ). В 1/2 Значения были определены из нормированных пиковых хвостовых токов при -120 мВ для каждого ооцита и подогнаны под уравнение Больцмана. F , G Способность медленной деактивации HK V 7,1 в High K + ( F ) и High RB + ( G ) в допупели. K + , N = 18 для RB + ) и присутствия (серый; N = 9 для K + и N = 18 для RB + ) OF (4444444444 = 18 для RB + 6) OF (4444444444 = 18 для RB + ) OF (4444444 = 18 для RB + ) OF (44444 = 18 = 184444 = 184444444 гг. -Л3. Постоянные времени τ slow deact определяли с помощью двухкомпонентной экспоненциальной аппроксимации для каждого ооцита и шага напряжения. h Изображение KCNQ1 в активированном состоянии (AO, получено из Kuenze et al 38 . Аминокислоты, важные для активности ( R )-L3 (пурпурный цвет), расположены в нижней части S5 (зеленый) и S6 (синий) спираль.Большинство боковых цепей важнейших аминокислот ориентированы на линкер S4S5 (оранжевый) и VSD (желтый) соседней субъединицы KCNQ1. -L3 Несколько ранее идентифицированных аминокислот, имеющих решающее значение для активности соединения, расположены на границе раздела между VSD и PD.Особенно остатки из внешней спирали S5, ориентированные на VSD, такие как Y267, L271 и G272, оказывают сильное влияние на активность соединения, участвуя в возможных взаимодействиях ( R )-L3 также с ЧРП (рис. 2з). Чтобы проанализировать, влияет ли взаимодействие ( R )-L3 на движения ДМЖП, зависящие от напряжения, мы провели эксперименты по флуорометрии с зажимом напряжения (VCF), которые связывают движение ДМЖП с проводимым током. Мы использовали конструкцию K v 7.1 K v 7.1 VCF , в которой два внеклеточно доступных цистеина (C214A/C331A) были удалены, а новый цистеин (G219C) был введен в VSD для сайт-специфического прикрепления Alexa. 488-С5 малеимид. К v 7.1 VCF позволяет контролировать движение преобразователя частоты в зависимости от напряжения 30,31 . Поскольку мутации могут изменять активность модуляторов канала, мы сначала исследовали влияние высокой концентрации ( R )-L3 (10 мкМ) на канал K v 7,1 VCF . Как показано на рис. 3a, b, 10 мкМ ( R )-L3 способны активировать канал K v 7,1 VCF на 58 ± 20% ( n = 4, СЭМ). Хотя активность ( R )-L3 уменьшен по сравнению с каналами дикого типа, активации по-прежнему достаточно для анализа влияния ( R )-L3 на движение ДМЖП путем одновременной регистрации тока и флуоресценции для каждого ооцита (рис. 3c–g). . Подобно наблюдаемым эффектам на канале дикого типа ( R )-L3 сдвигает V 1/2 K v 7,1 VCF для G / G max 3 a Токи целых клеток из ооцита, экспрессирующего K v 7,1 VCF , помеченный малеимидом Alexa 488 C5. Каждые 15 с напряжение на мембране пульсировало от потенциала покоя -80 мВ до +60 мВ в течение 4 с, за которым следовали 2-секундные хвосты при -40 мВ. Токи до (черный) и после (красный) введения болюса ( R )-L3 в ванну (конечная концентрация ~10 мкМ). b Установившийся ток при +60 мВ в зависимости от времени во время применения ( R )-L3 (обозначен красной полосой). Черная линия представляет собой среднее значение, серые точки представляют необработанные данные каждого измерения ( n = 4). c Импульсный протокол для одновременной регистрации тока и флуоресценции в ( d — g ). d Образец текущей кривой от одного ооцита до (черный) и после (красный) воздействия ~ 10 мкМ ( R )-L3. e G / G макс. зависимость напряжения K v 7,1 VCF , экспрессирующие ооциты в отсутствие (черный) и в присутствии (красный) ( R ‡ )-L3 4 для обоих условий). f Образец следа флуоресценции ооцита до (черный) и после (красный) воздействия ~ 10 мкМ ( R )-L3. g Соотношение напряжения dF/F для K и 7,1 VCF , экспрессирующих ооциты в отсутствие (черный) и в присутствии (красный) ( R )-L3 ( n = 4 для обоих условий). Изображение в полный размер Действительно, большая бензодиазепиновая область ( 9Предполагается, что 0843 R )-L3 связывается с внешним S5, который, в свою очередь, как ожидается, взаимодействует с VSD каналов K v в открытом или инактивированном состоянии 32 . Таким образом, сайт связывания может перекрываться с поверхностью взаимодействия между VSD и PD. В частности, нижний спиральный трансмембранный сегмент S4 и бензодиазепиновая часть могут взаимодействовать с аналогичными областями нижнего S5. Чтобы идентифицировать отдельные взаимодействующие аминокислоты, которые отвечают за модуляцию движений ДМЖП с помощью ( R )-L3, мы провели аланин-сканирующий мутагенез нижнего трансмембранного сегмента S4 (остатки 235–241) и оценили, сохраняются ли модулирующие эффекты ( R )-L3 на амплитуду тока и кинетику канала (рис. 4). Поскольку мутации в самой спирали S4 могут изменять свойства канала, измерения того же мутанта или канала дикого типа в отсутствие ( R )-L3 служат в качестве контроля (рис. 4a–d). Мы обнаружили, что эффекты ( R )-L3 на амплитуду тока могут не влиять (I235A, M238A, L239).A и V241A), значительно увеличилось (R237A и h340A) или уменьшилось (L236A) за счет соответствующего аминокислотного обмена (рис. 4e). Эти результаты показывают, что L236, R237 и h340 участвуют в модуляторном механизме ( R )-L3. a – d Репрезентативные текущие следы каналов дикого типа ( a ) и мутантных каналов L236A ( b ), R237A ( c ) и h340 ( д ). e Активация амплитуды тока мутантов канала K v 7.1 с помощью 1 мкМ ( R )-L3, выраженная в процентах изменения тока, измеренного в конце 7-секундного импульса, до +40 мВ ( n = 30 Для WT, N = 13 для I235A, N = 18 для L236A, N = 12 для R237A, N = 18 для M238A, N = 13 для L239A, 444444444444444444 гг. , n = 16 для V241A). Значимость различий средних оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа и теста Тьюки для сравнения апостериорных средних (* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001). f – i Влияние ( R )-L3 на скорость активации и деактивации мутантных каналов hK v 7. 1. Кинетику оценивали как в отсутствие, так и в присутствии 1 мкМ ( R )-L3 и аппроксимировали двухкомпонентной экспоненциальной функцией (количество независимых ооцитов для ( f – i ) указано в таблице SI 3). Изображение полного размера Поскольку модулятор замедляет кинетику активации и деактивации в каналах дикого типа, оценивали влияние на кинетику мутантных каналов и сравнивали с кинетикой того же мутантного канала в отсутствие ( Р )-L3. Для всех мутантных каналов, кроме I235A, не наблюдалось существенного изменения кинетики активации, указывающего на прямое или косвенное участие этих остатков в молекулярном механизме ( R )-L3 (рис. 4f, g). Хотя эффект замедленной дезактивации ( R )-L3 все еще присутствует для L236A, h340A и V241A, мутации I235A, R237A, M238A и L239A не оказывают влияния на поведение дезактивации в присутствии ( R )-L3. (рис. 4з, и). Интересно, что предыдущие связанные эффекты на кинетику канала и амплитуду тока ( R )-L3 становятся более разобщенными из-за исследованных мутаций нижнего S4. Суммируя результаты, можно сказать, что только мутации от R237 до L239 были способны устранить как эффекты активации канала, так и кинетику деактивации. Из этих остатков мутация M238A показала наиболее заметное снижение агонистического эффекта на амплитуду тока. Чтобы оценить актуальность ключевого взаимодействующего остатка M238 для ( R )-L3 агонизм при нормальном закрытии канала мы провели эксперименты по фотосшиванию (рис. 5a–f). Моделирование предполагает возможное физическое взаимодействие M238 с внешней порой соседней субъединицы остатком S5 I274 в активированном состоянии (рис. 5c). Эта гипотеза подтверждается опубликованными крио-ЭМ структурами KCNQ1 (идентификатор PDB 6UZZ), которые показывают VSD в активированном состоянии 33 . Перестройка ДМЖП приводит к отчетливому вращению, а также к восходящему движению S4, что приводит к прямому взаимодействию с S5 34 . Следовательно, расстояние между M238 и I274 сокращается in silico , входя в диапазон, где возможны прямые взаимодействия. Предполагаемое взаимодействие оценивали путем включения фотоактивируемой неканонической аминокислоты p -азидофенилаланин (AzF) в положение K v 7,1 M238 (M238AzF) с использованием метода подавления янтаря в клетках HEK (рис. 5a– г) 35 . Применение буфера с высоким содержанием K + (137 мМ) деполяризовало клетки в пользу датчиков напряжения в активированном состоянии, что привело к M238AzF-опосредованному межсубъединичному фотосшиванию, как показано образованием K 9Мультимеры 0823 v 7.1 в Вестерн-блоттинге (рис. 5e). Эти наблюдения согласуются с предполагаемым взаимодействием между M238AzF и соседним поровым доменом субъединицы (S5-S6), которое, как ожидается, приведет к ковалентным связям между субъединицами. В качестве альтернативного, но гораздо менее специфичного для сайта подхода мы оценили глобальное включение фотометионина (pMet). Подобно результатам для M238AzF, включение pMet позволило провести фотосшивание и стабильное образование мультимеров K v 7.1 в Вестерн-блоттинге при высоком K 9раствор 0325 + Взаимодействия с нижним S4, выявленные при аланиновом сканировании
M238 играет решающую роль в механизме (
R )-L3 и связывании VSD-PD
a , b Используя метод подавления янтаря для включения неканонических аминокислот (ncAA), мы ввели фотоактивируемую неканоническую аминокислоту AzF ( b ) в положение M238 в мутант K v 7.1-EGFP-M238AMBER-Стоп. Клетки HEK котрансфицировали кДНК, кодирующей K v 9.0824 7.1-EGFP-M238amber-Stop, супрессор тРНК и синтетаз AzF-тРНК. Добавление ncAA p -азидофенилаланина (AzF) в концентрации 0,5 мМ к среде для культивирования клеток позволило включить ncAA. c I274 взаимодействует с M238 соседней субъединицы в активированном состоянии in silico . d Успешное включение и экспрессию полноразмерного белка оценивали с помощью конфокальной визуализации EGFP. e K v Клетки HEK, экспрессирующие 7.1-EGFP-M238AzF, инкубировали в среде с высоким K + растворов (137 мМ KCl), приводящих к каналам преимущественно в деполяризованном (вычисленное V m около -8,9 мВ) состояниях. УФ-облучение вызывало образование мультимеров при высоких K + / преимущественно деполяризующих условиях, что согласуется с предсказанным взаимодействием. f Нормализованные токи hK v 7,1 WT и hK v 7,1 M238C/I274C, экспрессирующие ооциты в отсутствие и в присутствии ( R )-L3 и Co 2+ ионов (количество ооцитов для каждого состояния см. Таблицу SI 2).
Полноразмерное изображение
In silico анализ процесса связывания ( R )-L3 с каналом K v 7.1различных состояний ионных каналов для стыковки ( R )-L3 и последующего моделирования молекулярной динамики (МД) 38 . Используемые модели ионных каналов представляют собой гомотетрамерные структуры, состоящие из четырех α-субъединиц (Mol A–Mol D), и отображают рецептор с активированной VSD и открытой порой (AO), активированной VSD и закрытой порой (AC) и покоящимся ЧСД с закрытой порой (ЗК). Используя результаты мутационного анализа, мы построили комплексы ( R )-L3 и три различных состояния рецептора (AO, AC, RC) путем ручной стыковки лиганда в карман между S4 и линкером S4S5 Mol B с индол-3-ильной частью, ориентированной между α-спиралями S5 и S6 из Mol A (рис. 6a–c). Сгенерированные комплексы лиганд/рецептор были минимизированы по энергии и встроены в липидные мембраны, окруженные молекулами воды (рис. 6d). После второго этапа отжига и минимизации энергии МД-моделирование продолжительностью 30 нс выполняли 3 (RC, AC) или 5 (AO) раз для сгенерированных комплексов лиганд/рецептор.
Рис. 6: Локализация сайта связывания и результаты моделирования in silico .a Изображение тетрамерной модели АО KCNQ1 с субъединицами, окрашенными в пурпурный (Mol A), желтый (Mol B), зеленый (Mol C) и синий (Mol D). Предлагаемый сайт связывания ( R )-L3 отмечен красным квадратом. b Крупный план сайта связывания ( R )-L3 (CPK-цвет, кодированный голубым для углерода) с S4 (желтый) и линкером S4S5 (оранжевый) из субъединицы Mol B и спирали S5 и S6 (пурпурный) из субъединицы Mol A. Ранее проанализированные аминокислоты из S5 и S6 воздействовали на ( 9Активность 0843 R )-L3 окрашена в фиолетовый цвет, тогда как вновь проанализированные остатки линкера S4 и S4S5 окрашены в зеленый или фиолетовый цвет. c Схематическое изображение сайта связывания ( R )-L3 между линкером S4 (желтый) и линкером S4S5 (оранжевый) из субъединицы Mol B и S5 и S6 (розовый) из субъединицы Mol A. d Изображение модели АО KCNQ1 встроенный в мембрану для моделирования МД. Субъединицы Mol A-D окрашены, как на 5А, а сайт связывания ( R )-L3 отмечен красным квадратом. e Среднеквадратичное отклонение (RMSD) 30 нс MD-моделирования для полных смоделированных структур AO (n = 5 симуляций), AC ( n = 3) и RC ( n = 3) с ( R ) -L3 для каждой симуляции. Средние значения показаны в виде столбцов и не имеют существенных различий, обозначенных ns. f RMSD движения лиганда ( R )-L3 от начала до конца 30 нс MD моделирования состояний KCNQ AO ( n = 5), AC ( n = 3) и RC ( n = 3). г ( R )-L3 Среднеквадратичная флуктуация (RMSF) для 30 нс МД моделирования с моделями состояния KCNQ1 AO ( n = 5), AC ( n = 3) и RC ( n = 3). Средние различия недостоверны (ns; p > 0,05). ч Энергия связи [кДж/моль] ( R )-L3 рассчитана для всех моментальных снимков симуляции от 10 до 30 нс МД моделирования для моделей KCNQ1 AO ( n = 405 снимков), AC ( n = 243) и RC ( n = 243). i Длительность гидрофобного взаимодействия между ( R )-L3 и мутантными аминокислотами из линкера S4 и S4S5 в процентах от общего времени моделирования MD 30 нс для моделирования АО ( n = 5). j , k RMSD и RMSF основной цепи мутантных остатков в отсутствие ( n = 3 моделирования)/наличии ( n = 5 моделирования) ( R )-L3. l активность 1 мкМ ( R )-L3 в ооцитах дикого типа, экспрессирующих KCNQ1, по сравнению с мутациями W248F, W248A и W248R ( n = 4 для WT, n = 5 для W248F, W248A и W248R).
Изображение в натуральную величину
Для анализа моделирования МД мы использовали такие параметры, как среднеквадратичное отклонение (RMSD), среднеквадратичное отклонение (RMSF) и корреляцию движения остатков, выраженную динамическими матрицами взаимной корреляции (DCCM). RMSD может быть рассчитан для нескольких или отдельных аминокислот или даже атомов и отображает общее движение от начала моделирования до конца, в то время как RMSF отображает колебания вокруг среднего положения. После 30 нс моделирования общее среднеквадратичное отклонение комплексов лиганд/рецептор постоянно колебалось вокруг стационарного значения, указывающего на стабильное образование. Хотя общие СКО уменьшаются от АО-комплексов к RC-комплексам, средние значения существенно не различались (рис. 6e). Напротив, СКО для ( R )-L3, который отображает движение лиганда от исходного положения с минимизацией энергии, было значительно уменьшено для АО-комплекса (рис. 6f). Поскольку RMSF лиганда существенно не отличалась, разные RMSD должны быть вызваны перемещением всего лиганда, а не переориентацией цепей сайтов лиганда (рис. 6g). Все смоделированные комплексы показывают постоянно колеблющееся среднеквадратичное отклонение лиганда после времени уравновешивания 10 нс. Следовательно, энергия связывания для каждого комплекса лиганд/рецептор рассчитывалась от 10 нс до 30 нс каждые 0,25 нс. Самые высокие энергии связывания наблюдались в АО-комплексах, что свидетельствует о лучшем связывании ( R )-L3 в это состояние ионного канала (рис. 6h). Вместе с уменьшенным RMSD лиганда в состоянии АО эти результаты приводят к выводу о предпочтительном связывании с полностью активированным состоянием АО-рецептора.
Ароматические взаимодействия между (
R )-L3 и W248 имеют решающее значение для активности. нижний сегмент S4. Только гидрофобные взаимодействия с L236, M238, L239и V241 были обнаружены. Кроме того, наблюдалось сильное ароматическое взаимодействие между W248 из линкера S4S5 (Mol B) и 2-хлорфенильным фрагментом. На рисунке 6i показана относительная продолжительность взаимодействия в течение всего времени моделирования, что указывает на сильное влияние W248 на связывание. Следовательно, мы включили W248 в дальнейшие анализы. В то время как для связывания соединения необходимы определенные взаимодействия с рецептором, механизм активации осуществляется за счет измененных движений белка в присутствии лиганда. Чтобы обнаружить эти движения, мы выполнили три дополнительных 30-нс MD-симуляции модели АО-состояния без лиганда для сравнения. Удивительно, но исследованные аминокислоты в S4 (Mol B) не показали существенно различающихся значений RMSD или RMSF, что указывает на сходное поведение для присутствия и отсутствия ( R )-L3 (рис. 6к, л). Напротив, среднеквадратичное отклонение W248 от линкера S4S5 (Mol B) было значительно снижено без значительного изменения среднеквадратичного отклонения, что предполагает ингибирование движения аминокислоты в присутствии ( R )-L3.Из-за часто обнаруживаемых ароматических взаимодействий с лигандом in silico и измененного поведения W248 в присутствии ( R )-L3 были созданы дополнительные мутанты W248F, W248A и W248R. Измерения TEVC выявили значительную потерю ( R )-L3 для всех мутантов по сравнению с диким типом, что подчеркивает участие W248 в молекулярном механизме действия (фиг. 6l). Сравнение активности 1 мкМ ( R )-L3 на ароматическом мутанте W248F (34 ± 6%, SEM, n = 5) с активностью на W248A (20 ± 6%, SEM, n = W248R (10 ± 3%, SEM, n = 4) позволяют сделать вывод, что не только размер, но и ароматичность аминокислоты в этом положении, по-видимому, важны для агонистического механизма. Поскольку ароматические взаимодействия также возможны с фенилаланином, мутант W248F представляет собой лишь частичное нарушение взаимодействия соединение/канал в этом положении. Эта гипотеза также согласуется с параметрами активации и деактивации мутантов W248 в присутствии и в отсутствие ( R )-L3 (СИ Рис. 3). В то время как не наблюдается значительного изменения констант времени активации или деактивации при применении ( R )-L3 в ооцитах, экспрессирующих W248A и W248R, что свидетельствует о нарушении кинетических модулирующих эффектов с помощью ( R )-L3, ооциты, экспрессирующие W248F, демонстрируют значительное изменение в кинетика дезактивации в присутствии ( R )-L3, который также обнаружен в каналах дикого типа.
Измерения VCF для предполагаемых взаимодействующих аминокислот
Чтобы более подробно охарактеризовать влияние наиболее важных взаимодействующих аминокислот M238, V241 и W248, мы попытались записать дальнейшие эксперименты VCF с использованием аланиновых мутантов этих остатков. Однако достаточные сигналы флуоресценции были обнаружены только для мутации V241A (SI, рис. 4). Тот факт, что низкие токи в TEVC отражают недостаточное сайт-специфическое присоединение малеимида Alexa 488-C5, допускающее VSD, предполагает слабую экспрессию этих мутантов на плазматической мембране, как описано для каналов KCNQ1 с мутацией S4 до 9.0325 39,40,41 . Поскольку VCF является методом с низким отношением сигнал/шум, несколько мутированных слабоэкспрессирующих каналов K v 7.1 не удалось проанализировать. Compared to the wildtype channel, K v 7.1 VCF V241A showed right-shifted V 1/2 values of −29 ± 1 mV ( G / G max ) and −25 ± 1 мВ (дФ/Ф). В присутствии ( R )-L3 типичный сдвиг влево к более отрицательным значениям наблюдается с V 1/2 значений −35 ± 1 мВ ( G / G макс. ) и −29 ± 2 мВ (dF/F). Однако по сравнению с диким типом эти сдвиги гораздо менее выражены, что согласуется с прямым участием взаимодействия соединение/остаток в агонистическом механизме.
Влияние связывания (
R )-L3 на связывание VSD-PD in silicoХотя по шкале отдельных взаимодействующих аминокислот обнаружены лишь незначительные различия, значительные различия наблюдались в коммуникационном поведении сайтов связывания, образующих сегменты S4 (Mol B), линкер S4-S5 (Mol B), S5 (Mol A ) и S6 (молекулярная А) (рис. 7а). Чтобы визуализировать измененную связь между сегментами, DCCM были рассчитаны для всех симуляций и усреднены в зависимости от наличия или отсутствия ( R )-L3 (рис. 7b–j). DCCM был рассчитан для пары атомов Cα в течение всего времени моделирования MD и отображал поведение движения выбранных атомов в диапазоне от -1 (полностью антикоррелированные движения) через 0 (отсутствие корреляции движения) до 1 (полностью коррелированные движения). Хотя спираль S4 (Mol B) и линкер S4S5 (Mol B) находятся на близком расстоянии и на одной и той же субъединице, их движения не координировались при моделировании без ( R )-L3 (рис. 7b). В присутствии лиганда можно было наблюдать отчетливое увеличение координированных движений между нижним сегментом S4 с соседними остатками линкера S4S5 (рис. 7c, d). Напротив, естественная связь и корреляция движения между S4 (Mol B) и соответствующей спиралью S5 (Mol A) были почти устранены (рис. 7e–g). В соответствии со сниженной корреляцией между S4 и S5 также были уменьшены одновременные движения S5 и линкера S4S5 (SI Fig. 5a–c). Наличие ( R )-L3 также генерировал слабую связь между S4 (Mol B) и S6 (Mol A), в то время как в нормальных условиях между этими сегментами не было обнаружено дальнодействующей связи (рис. 7h–j). В частности, увеличилась корреляция движения между M238 и окружающими остатками из S4 с остатками A336–F340, непосредственно взаимодействующими с ( R )-L3. Однако эти различия были менее выражены, чем изменения сцепления между S4, линкером S4S5 и S5. Более выраженное усиление сцепления было достигнуто за счет ( R )-L3 для нижней спирали S6 со всей спиралью S5 (SI, рис. 5d–f), в то же время S6 был отсоединен от движений линкера S4S5 (SI, рис. 5g–i). Обобщая связь движения, присутствие ( R )-L3 отделяет движения VSD от PD за счет уменьшения корреляции между S4 и S5 и одновременного увеличения корреляции между линкерами S4 и S4S5 и между доменом внутренней поры, образующим спирали. С5 и С6.
Рис. 7. Динамические кросс-корреляционные матрицы (DCCM) для взаимодействий между VSD (линкер S4, S4S5) и PD (S5, S6).a ( R )-L3 (цветовой код CPK с голубым для углерода) сайт связывания между субъединицами Mol A и B с взаимодействующими вторичными структурами S4 (Mol B, желтый), линкер S4S5 (Mol B, оранжевый) , S5 (Mol A, зеленый), S6 (Mol A, синий) и селективный фильтр (Mol A, фиолетовый). Первая и последняя аминокислоты всех вторичных структур показаны одним цветом. b , c Динамическая кросс-корреляционная матрица (DCCM) для S4 (Mol B, желтый) и линкера S4S5 (Mol B, оранжевый) в отсутствие ( b ) и присутствие ( c ) ( R )-L3 от -1 (полностью антикоррелированные) от 0 (не коррелированные) до 1 (полностью коррелированные). d Увеличение (положительные значения, красный цвет) и уменьшение (отрицательные значения, синий цвет) корреляции между линкерными остатками S4 и S4S5 в зависимости от присутствия ( R )-L3. e , f DCCM для S4 (Mol B, желтый) и S5 (Mol A, зеленый) в отсутствие ( e )/присутствии ( f ) ( R )-L3. г Увеличение (положительные значения, красный цвет) и снижение (отрицательные значения, синий цвет) корреляции между остатками S4 и S5 в зависимости от присутствия ( R )-L3. h , i DCCM для S4 (Mol B, желтый) и S6 (Mol A, синий) в отсутствие ( h )/присутствии ( i ) ( R )-L3. j Увеличение (положительные значения, красный) и уменьшение (отрицательные значения, синий) корреляции между остатками S4 и S6 в зависимости от присутствия ( Р )-L3. Все данные на рис. 7 получены из 5 независимых симуляций в присутствии и 3 независимых симуляций в отсутствие ( R )-L3.
Изображение в полный размер
Поскольку ( R )-L3 увеличивает амплитуду тока K v 7. 1, можно предположить аллостерическую связь между структурами, образующими сайт связывания, и соседними остатками фильтра селективности (рис. 8a). Следовательно, были проанализированы СКО аминокислот V310–P320 (Mol A) и их сочетание с S4, линкером S4S5, S5 и S6 (рис. 8b–o). Сравнивая среднеквадратичное отклонение скелета остатка в отсутствие и в присутствии ( R )-L3 аминокислоты V310–T312 и K318–P320 продемонстрировали умеренное, но незначительное увеличение движения при связывании лиганда (рис. 8b). Однако усредненное среднеквадратичное отклонение основной цепи для V310–P320 было значительно увеличено, что свидетельствует о повышенном движении всего сегмента селективного фильтра (рис. 8c). Как и в предыдущих результатах для S4, корреляция движения S4 с фильтром селективности уменьшилась. В частности, корреляция между M238 и нижними остатками была погашена лигандом (рис. 8d–f). Напротив, между линкером S4S5 и низшими аминокислотами фильтра селективности наблюдалась слегка повышенная корреляция движения (рис. 8g-i). В то время как внешние структуры показали лишь незначительные корреляционные различия с V310–P320, две внутренние спирали S5 и S6 почти меняют свое поведение по отношению к фильтру селективности (рис. 8j–o). S5 теряет корреляцию, особенно с аминокислотами T312–K318, в то время как S6 достигает более высокой степени корреляции с фильтром с более низкой селективностью. Особенно F339, который напрямую связан с индол-3-ильной частью ( R )-L3 посредством ароматических взаимодействий, усиливал его связывание движения с V310–I313. Таким образом, ( R )-L3 повышает подвижность V310-P320 и изменяет сцепление этих остатков, увеличивая корреляцию движения с S6 и одновременно уменьшая ее с S4 и S5.
Рис. 8: Динамические матрицы взаимной корреляции (DCCM) для взаимодействия между поровой спиралью и S4-S6.a Крупный план ( R )-L3 сайт связывания с S4 (желтый), линкер S4S5 (оранжевый), S5 (зеленый), S6 (синий) и селективный фильтр (фиолетовый) со всеми аминокислотами от V310 до P320. b , c СКО селективности Остатки на фильтрах V310 – P320 по отдельности ( b ) и в сумме ( c ) в отсутствие (черный) и в присутствии (красный) ( R )-L3. Средние значения даны в виде квадратов ( b ) или столбцов ( c ). ( d , e ) Динамическая кросс-корреляционная матрица (DCCM) для S4 (Mol B, желтый) и фильтра селективности (Mol A, фиолетовый) в отсутствие ( d ) и присутствие ( e ) ( R )-L3 от -1 (полностью антикоррелированные) от 0 (не коррелированные) до 1 (полностью коррелированные). f Увеличение (положительные значения, красный) и уменьшение (отрицательные значения, синий) корреляции между S4 и остатками селективного фильтра в зависимости от присутствия ( R )-L3. г , ч DCCM для линкера S4S5 (молекулярный B, оранжевый) и селективного фильтра (молекулярный A, фиолетовый) в отсутствие ( г )/присутствии ( ч ) из ( R )-L3. ( i ) Увеличение (положительные значения, красный цвет) и уменьшение (отрицательные значения, синий цвет) корреляции между линкером S4S5 и остатками фильтра селективности в зависимости от присутствия ( R )-L3. j , k DCCM для S5 (Mol A, зеленый) и селективный фильтр (Mol A, фиолетовый) в отсутствие ( j )/присутствии ( k ) ( R )-L3. l Увеличение (положительные значения, красный цвет) и уменьшение (отрицательные значения, синий цвет) корреляции между S5 и остатками фильтра селективности в зависимости от присутствия ( Р )-L3. m , n DCCM для S6 (Mol A, синий) и селективный фильтр (Mol A, фиолетовый) в отсутствие ( m )/присутствии ( n ) ( R )-L3. o Увеличение (положительные значения, красный) и уменьшение (отрицательные значения, синий) корреляции между S6 и остатками селективного фильтра в зависимости от присутствия ( R )-L3. Все данные на рис. 8 получены из 5 независимых симуляций в присутствии и 3 независимых симуляций в отсутствие ( Р )-L3.
Изображение с полным размером
Обсуждение
В настоящем исследовании мы проанализировали сайт связывания и механизм действия известного модулятора K v 7. 1 ( R )-L3, который замедляет активацию и деактивацию каналов и увеличивает амплитуда тока (рис. 1) 23 . Амплитуда тока, кинетика инактивации, активации и дезактивации зависят от вида внешнего иона через аллостерические эффекты в поровой области 19,26 . Основываясь на этом явлении, мы использовали различные растворы внешних ионов, чтобы оценить, являются ли эффекты ( R )-L3 результатом прямой модуляции частичного разряда. Действительно, приращение скорректированной амплитуды хвостового тока на ( R )-L3 уменьшается в 100 мМ K + , а также в 100 мМ Rb + и, следовательно, зависит от вида и концентрации внешнего иона (рис. 2c). ). С другой стороны, было идентифицировано, что остатки в поровом домене S5-S6 участвуют как в формировании ( R )-L3 сайт связывания 23 , а также образование аллостерически связанного кластера среди фильтров с более низкой селективностью. В частности, Y267, I268 и L271 имеют решающее значение для активности ( R )-L3. Эти остатки также принимали непосредственное участие в связывании in silico ( R )-L3, образуя ароматические и гидрофобные взаимодействия с соединением (рис. 6b). Таким образом, S5 и S6 определяют амплитуды тока и инактивацию 19,26,42 . Модулятор может аллостерически влиять на путь проведения, обеспечивая увеличение скорости проведения. На это также указывает повышенное среднеквадратичное отклонение остатков, образующих фильтр селективности (рис. 8c). Напротив, ( 9Эффекты 0843 R )-L3 на кинетику дезактивации тока аналогичны в высоких концентрациях Na + , K + и Rb + (рис. 2F, G, SI, рис. 1), что указывает на то, что активность модулятора может быть функционально разделены по стимулирующему эффекту амплитуды тока посредством модуляции проводящего пути и второму ( R )-L3 влиянию на кинетику тока по другому механизму.
Влияние ( R )-L3 на кинетику тока может быть вызвано изменением движения датчика напряжения. Для подтверждения этой гипотезы была проведена флюорометрия с зажимом напряжения (VCF), которая показала, что ( 9За эффектами 0843 R )-L3 следуют параллельные сдвинутые влево кривые GV и FV (рис. 3). Этот вывод согласуется с математическим моделированием, предполагающим, что модулятор предпочитает открытое состояние закрытому 23 . Таким образом, помимо прямого воздействия на поровую область наблюдаются отдельные воздействия на VSD.
При проверке модели гомологии K v 7.1 идентифицированные остатки S5-S6 указывают на сайт связывания от поверхности S5 и S6 (индол-3-ильная боковая цепь) до внешнего S5 (бензодиазепиновая часть). Особенно в активированном состоянии VSD внешний S5 K 9Канальная субъединица 0823 v , как ожидается, будет расположена в непосредственной близости от первичной спирали измерения напряжения S4 соседней субъединицы, что позволяет предположить, что ( R )-L3 может также взаимодействовать с S4. Использование классического сканирования мутагенеза нижнего S4 идентифицирует несколько остатков, модулирующих активацию каналов K v 7. 1. Наиболее резкое влияние на эффекты ( R )-L3 наблюдалось при мутациях в R237 и M238, которые значительно притупляли потенциацию тока и кинетическую модуляцию (рис. 4, SI, рис. 3a). Другие мутанты нарушали действие соединений либо на активацию, либо на деактивацию, либо на амплитуды тока, но не на все параметры. Однако из-за ориентации боковой цепи прямые взаимодействия между остатком и соединением возможны только для M238 9.0843 in silico проверка обеих доступных крио-ЭМ структур 33,43 . Следовательно, M238 можно считать ключевым остатком для активности ( R )-L3.
Недавно был предложен двухступенчатый ручно-локтевой запорный механизм для К v 7.1. Движение S4 к полностью активированному проводящему состоянию зависит от локтевого шарнира между линкерами S4 и S4S5, который взаимодействует с порой соседней субъединицы, чтобы активировать проводимость 37 . На основе этой модели открытого состояния можно предсказать взаимодействие M238 с соседним доменом S5-S6 в силиконе. Чтобы проверить эту гипотезу in vitro, мы адаптировали подход фотосшивки и показали сшивку M238AzF с соседней субъединицей в открытом состоянии (рис. 5). Далее функциональное влияние междоменного взаимодействия М238 оценивали по CoCl 2 , что подтверждает нашу гипотезу. Поскольку расстояние между M238 и I274 зависит от конформации VSD, взаимодействие между этими остатками предпочтительно в активированном состоянии VSD. Таким образом, M238 был идентифицирован как ключевой остаток для ( R )-L3, а также потенциальный ключевой игрок для связи VSD-PD.
Для дальнейшей оценки сайта связывания мы использовали различные модели каналов K и 7.1 (состояние AO, AC и RC) и вручную состыковали молекулу ( R )-L3, предполагая непосредственную близость ключевых остатков. Таким образом, руководствуясь экспериментально идентифицированными ключевыми остатками в S5/S6 23 и S4 (M238), мы разработали модель in silico (рис. 6). В МД-моделировании ( R )-L3 стабильно координировался в течение 24 ± 5,45 нс ( n = 5) только к модели АО с предполагаемым карманом связывания в непосредственной близости от ключевых остатков, предполагая благоприятное связывание только в полностью активированном состоянии. При проверке модельного комплекса остаток W248 в линкере S4S5 был идентифицирован как вероятный партнер для взаимодействия. Чтобы проверить нашу модель и влияние W248 in vitro, мы мутировали природный триптофан и обнаружили, что он очень важен для активности модулятора на канале K v 7.1 (рис. 6d). Таким образом, обширные данные свидетельствуют о том, что ( R )-L3 связывается в кармане связывания, образованном линкером S4, S4-S5 и поровым доменом S5/S6 соседней субъединицы канала K v 7.1, который является ключевой областью электромеханического связывания в K v 7.1-активация в зависимости от напряжения 37 . ( R )-L3-индуцированное разобщение ключевого остатка M238 от соседнего S5-S6-домена и низшего K + -координирующего остатка T331 в фильтре с более низкой селективностью в открытом состоянии может обеспечить более высокую проводимость. Стабилизация взаимодействий между похожим на руку С-концом линкера VSD-поры (S4-S5L) с порой (S5-S6) стабилизирует конформацию полностью активированного состояния, как предполагает кинетическое марковское моделирование. Кроме того, выпрямленная спираль S6 обеспечивает типичную для KCNQ1 структурно-функциональную связь с влиянием на дезактивацию и функцию фильтра селективности 42,44 . Кроме того, эта гипотеза хорошо согласуется с коррелированным перемещением M238 и сегментов S4S5 линкера и селективности фильтра. Без ( R )-L3 движение M238 коррелирует с остатками из фильтра селективности (фиг. 8d; остатки V310-Y315), особенно с T312, в то время как с линкером S4-S5 не наблюдается скоординированного движения (фиг. 7в). В присутствии ( R )-L3 это поведение по отношению к линкеру и фильтру селективности меняется на противоположное, что подчеркивает разделение VSD и домена пор соединением.
Недавно кверцетин был идентифицирован как активатор гомомерных каналов KCNQ1 45 . Механизм потенцирования тока KCNQ1 является результатом ускоренной активации, а также замедленной дезактивации. Подобно ( R )-L3, возможный сайт связывания соединения был обнаружен в непосредственной близости от F340, расположенного на нижней спирали S6. Функциональный анализ F340V показывает, что этот остаток прямо или аллостерически участвует в механизме активации, обеспечиваемом кверцетином. С другой стороны, исследования докинга, а также дальнейшие функциональные анализы указывают на связывание кверцетина по крайней мере с одним дополнительным и независимым сайтом связывания, что также функционально важно для механизма действия. Таким образом, кверцетин кажется менее специфичным и менее мощным по сравнению с (9).0843 Р )-L3.
Подводя итоги, можно сказать, что это исследование предоставляет доказательства существования двух отдельных молекулярных механизмов, позволяющих K v 7.1 активировать канал с помощью ( R )-L3: во-первых, амплитуды тока увеличиваются из-за связывания соединения с поровым доменом, аллостерически модулирующего ионный путь. Во-вторых, каналы K v 7.1 могут быть заблокированы в разомкнутых состояниях за счет стабилизации датчиков напряжения в активированном состоянии (up-state).
Материалы и методы
Мутагенез и гетерологичная экспрессия калиевых каналов
Сайт-направленный мутагенез кДНК K v 7.1 (GenBank Acc. No. NM_000218), субклонированной в вектор pXOOM, проводили с использованием стандартной ПЦР с удлинением мутантных олигонуклеотидов. Мутации были подтверждены автоматическим секвенированием ДНК. Конструкции линеаризовали с помощью NheI, а транскрипцию in vitro проводили с помощью набора mMessage mMachine (Ambion) с полимеразой Т7 в соответствии с инструкциями производителя. Качество синтезированной РНК проверяли гель-электрофорезом и количественно определяли спектрофотометрически.
Ооциты выделяли из долей яичника Xenopus laevis и ферментативно расщепляли коллагеназой (тип II, Worthington, 1 мг/мл в бескальциевом растворе Барта) в течение примерно 1,5–2 ч, как описано ранее. Ооциты стадии IV или V инъецировали 5 нг кРНК, кодирующей субъединицы K v 7.1 дикого типа или мутанта, и хранили в течение 3–4 дней при 18°C в растворе Барта, содержащем (в ммоль л -1 ): 88 NaCl, 1,1 KCl, 2,4 NaHCO 3 , 0,3 Ca(NO 3 ) 2 , 0,3 CACL 2 , 0,8 мгс. сульфат (20 мг л -1 ), pH 7,6 до электрофизиологической регистрации.
Электрофизиология и Co
2+ кросслинкингТоки целых клеток в ооцитах регистрировали при комнатной температуре с помощью двухэлектродной фиксации напряжения (TEVC) с использованием усилителя Turbo Tec 10CD (NPI Electronic GmbH, Тамм, Германия) и Интерфейс ITC-16 в сочетании с программным обеспечением GePulse (Michael Push, Genova, Италия). Регистрирующие пипетки, вытащенные из боросиликатного стекла, были заполнены 3 M KCl и имели сопротивление 0,4–1 МОм. Записи проводились в формате ND9.6 раствор, содержащий (в ммоль л -1 ) 96 NaCl, 4 KCl, 1 CaCl2, 1,8 MgCl2, 5 HEPES, pH 7,2-7,4 с 0,1% диметилсульфоксида. Для экспериментов с высокими внеклеточными концентрациями калия или рубидия стандартный раствор ND96 заменяли 100 мМ раствором KCl и 100 мМ раствором RbCl соответственно. ( R )-L3 добавляли в каждый раствор в ванне для получения конечной концентрации 1 мкМ из исходного раствора 10 мМ в ДМСО. Чтобы определить эффекты ( R )-L3 на дикий тип и мутантный K v 7.1 каналы, токи регистрировались повторяющимися 7-секундными импульсами до потенциалов от -100 мВ до +60 мВ, применялись с шагом 20 мВ, а затем удерживались в течение 3-секундного хвостового импульса при -120 мВ перед возвратом в режим удержания потенциал -80 мВ. Мутации могут влиять на кинетику ворот канала, экспрессию плазматической мембраны и, следовательно, на амплитуду тока. Каналы дикого типа и мутантные каналы, экспрессированные в Xenopus laevis , использовались только в том случае, если ток при +40 мВ был ≥0,5 мкА, что достаточно надежно для анализа. На протяжении всей рукописи ( 9Эффекты 0843 R )-L3 на различные мутанты KCNQ1 всегда обсуждаются по сравнению с контрольной записью на том же мутанте в отсутствие ( R )-L3. Следовательно, нет необходимости в корреляции экспрессии плазматической мембраны и ионного тока.
Co 2+ — перекрестное сшивание, основанное на хорошо известном сродстве переходных металлов к сульфгидрильным группам цистеинов 46 . Формирование таких металлических мостов возможно только в том случае, если Co 2+ ион, а также сульфгидрильные группы двух цистеинов находятся на правильном расстоянии и под углом друг к другу 47,48 . В результате образования могут ограничиваться конформационные изменения и впоследствии нарушаться функции белка. Для перекрестного связывания Co 2+ с цистеином ооциты инъецировали непосредственно перед измерениями с 2 ммоль л -1 CoCl2, а экспрессированные каналы активировали импульсом напряжения +40 мВ в присутствии и в отсутствие ( R ) -L3. . Полученный ток нормировали на ооциты, экспрессирующие тот же вариант Kv7.1 без инъекции CoCl2 и без ( R )-L3 применение.
Анализ данных
Данные анализировали с помощью специальной программы Ana и программного обеспечения GraphPad Prism 5.01 (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния). Все экспериментальные результаты представлены как среднее ± SEM, где n указывает количество независимых экспериментов. Статистический анализ проводили с помощью критерия Стьюдента t (непарного) или ANOVA. Кривые активации для каналов дикого типа и мутантных каналов K v 7.1 определяли из хвостовых токов при гиперполяризованных потенциалах путем построения нормированных пиковых амплитуд хвостовых токов в зависимости от соответствующего тестового потенциала. Полученные кривые были подогнаны под уравнение Больцмана, которое дало адекватную подгонку с двумя параметрами В 1/2 (напряжение полумаксимальной активации) и коэффициент наклона k. Кинетика активации была получена путем двойной экспоненциальной аппроксимации токов с получением быстрой и медленной констант времени активации. Константы скорости дезактивации также были получены с помощью двойной экспоненциальной аппроксимации хвостовых токов в отсутствие и в присутствии ( R )-L3 и нанесены на график в зависимости от приложенного мембранного потенциала.
Методы флюорометрии с зажимом напряжения (VCF)
В ооциты вводили 90,2 нг кРНК, кодирующей psWT K v 7. 1 (C214A/G219C/C331A), отдельно или одновременно с 2,3 нг кРНК, кодирующей CiVSP дикого типа. После инкубации в течение 3–7 дней при 18 C клетки метили в растворе с высоким содержанием K + (98 ммоль л -1 KCl, 1,8 ммоль л — 1 CaCl2, 5 ммоль л -62 903 HEP , pH 7,6) с 10 мкМ Alexa 488 C 5 -малеимида (Molecular Probes) в течение 45 мин на льду, промытый раствором ND96 (96 ммоль л -1 NaCl, 4 ммоль л -1 KCl, 1,8 ммоль л -1 CaCl 2 , 1 ммоль л -1 MgCl 2 , 5 ммоль л -1 HEPES) и сохраняли для сведения к минимуму повторного использования меченых каналов на льду. Записи VCF проводились в растворах ND96 + /- ( R )-L3. Записи флуоресценции были выполнены с использованием вертикального флуоресцентного микроскопа Leica DMLFS с фильтрующим кубом FITC. Излучение от анимального полюса было сфокусировано на фотодиоде с контактом 20 A (OSI Optoelectronics) и усилено с помощью патч-усилителя EPC10 (HEKA) и аналогового фильтра с частотой 200 Гц. Одновременные записи фиксации напряжения двумя электродами были измерены с использованием усилителя Dagan CA1-B в режиме TEVC. Сигналы тока и флуоресценции оцифровывались с частотой 1 кГц.
Культура клеток, трансфекция, фотосшивание и лизис клеток 1
пенициллин (Sigma-Aldrich), 10% фетальная телячья сыворотка (Biochrom) и 100 мкг мл -1 стрептомицин (Sigma-Aldrich) при 37 °C / 5% CO 2 . Для трансфекции клетки выращивали до 60–70% слияния в чашке диаметром 3,5 см. В экспериментах по подавлению янтаря соотношение плазмидной ДНК, используемое для трансфекции, составляло 1/1/0,2 (K v 7.1/супрессорная тРНК/AzF aaRS). Трансфекцию проводили с использованием FuGene HD (Promega) в соответствии с протоколом производителя. Для двойной трансфекции использовали 625 нг ДНК K v 7.1, 625 нг супрессорной тРНК ДНК и 125 нг ДНК aaRS на чашку диаметром 3,5 см. Для трансфекции дикого типа (wt) K v 7.1 использовали 1 мкг ДНК на чашку диаметром 3,5 см. Нетрансфицированные клетки служили контролем. Клетки, трансфицированные мутантами K v 7.1 amber, выращивали в присутствии 0,5 ммоль л −1 AzF (Chem-Impex) в среде. Клетки, экспрессирующие K v 7.1-M238AzF, собирали путем трипсинизации через 24–48 часов после трансфекции, центрифугировали, подвергали воздействию УФ-света с длиной волны 254 нм в течение 3 минут и снова осаждали. Осадок солюбилизировали в течение 30 мин при 4°С, а клеточные лизаты очищали с использованием набора для выделения µMacs GFP (Miltenyi Biotec) в соответствии с протоколом производителя. Выполняли SDS-PAGE и белки переносили на нитроцеллюлозные мембраны. После переноса белка мембраны окрашивали раствором Ponceau S (Sigma-Aldrich) и обесцвечивали забуференным физиологическим раствором Tris (TBS: 20 ммоль л -1 Трис, 150 ммоль л -1 NaCl). Для обнаружения K v 7.1 мембрану подвергали иммуноблотингу с моноклональным антителом K v 7. 1 (sc-365186, Santa Cruz Biotechnology) 1:200 в TBS-T (TBS + 0,1% Tween).Молекулярное моделирование
Молекулярное моделирование было выполнено с использованием YASARA 19 и OriginPro 2019 для анализа данных. K v 7.1 Структуры состояний канала AO, AC и RC были взяты из Kuenze et al. 38 . Параметры моделирования приведены в таблице SI 3. Файлы PDB различных состояний канала состоят из четырех идентичных субъединиц KCNQ1, названных Mol A – D. Структура ( R )-L3 был сконструирован с использованием YASARA 19 с определенной стереохимией и минимизацией энергии с использованием силового поля AMBER14. Основываясь на результатах предыдущих и проводимых в настоящее время исследований мутагенеза, минимизированную энергию ( R )-L3 вручную стыковали между Mol A и Mol B в непосредственной близости от всех взаимодействующих аминокислот из S4 (Mol B), S5 (Mol A) и S6 (Mol A) с последующей второй минимизацией энергии с использованием AMBER14 23 . Для моделирования МД в липидной мембране предоставленный YASARA 19Был использован макрос md_runmembrane.mcr, и были адаптированы следующие параметры: Состав мембраны был установлен на 1/3 фосфатидилэтаноламина (ФЭА), 1/3 фосфатидилхолина (ФХ) и 1/3 фосфатидилсерина (ФСЭ). Все полярные головные группы замещены 1-пальмитоил- и 2-олеоилом. Скорость моделирования была установлена на высокую (шаги времени моделирования 2 * 2,5 фс), а время моделирования было установлено на 30 нс. Процесс симуляции документировался снимками экрана каждые 0,25 нс, что в сумме дало 120 снимков экрана для каждой симуляции. RMSD, RMSF и DCCM рассчитывались с помощью предоставленных макросов YASARA md_analyze.mcr и md_analyzeres.mcr. Полное моделирование и анализ были проведены с использованием силового поля AMBER14.
Статистические данные и воспроизводимость
В соответствующих случаях значимость различий средних для всех данных была проанализирована с использованием OriginPro 2021 с помощью однофакторного дисперсионного анализа и сравнения апостериорных средних. < 0,01, *** p значений < 0,001 и ns (незначительно) для p значений > 0,05. Количество отдельных ооцитов или симуляций указано для каждого эксперимента в основной статье, подписях к рисункам или в дополнительной информации. Далее, 9Значения 0843 n могут быть восстановлены из дополнительных данных для каждой панели рисунка.
Сводка отчета
Дополнительная информация о дизайне исследования доступна в Кратком отчете об исследовании природы, связанном с этой статьей.
Ссылки
Лехтинен, А. Б. и др. Взаимосвязь между генетическими вариантами в миокардиальных генах натриевых и калиевых каналов и продолжительностью интервала QT у диабетиков: исследование диабетического сердца. Энн. Неинваз. Электрокардиол. 14 , 72–79 (2009).
Google ученый
Salata, J.J. et al. Новый бензодиазепин, который активирует токи K+ медленного замедленного выпрямления сердца. Мол. фарм. 54 , 220–230 (1998).
КАС Google ученый
Перец, А. и др. Нацеливание на датчик напряжения Kv7.2 потенциалозависимых K+ каналов с новым модификатором стробирования. Проц. Натл акад. науч. США 107 , 15637–15642 (2010 г.).
КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый
Zaydman, M. A. et al. Для ионных каналов Kv7.1 требуется липид, чтобы связать определение напряжения с открытием пор. Проц. Натл акад. науч. США 110 , 13180–13185 (2013).
КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый
Скачать ссылки
Производные бензо[1,2-b:6,5-b′]дитиофен(дитиазол)-4,5-диона: синтез, электронные свойства, кристаллическая упаковка и перенос заряда
Производные бензо[1,2-
b :6,5- b ′]дитиофен(дитиазол)-4,5-диона: синтез, электронные свойства, кристаллическая упаковка и перенос заряда†Юлия А. Гетманенко, и Марина Фонари, до н.э. Чад Риско, и Бхупиндер Сандху, c Елена Галан, д Линюнь Чжу, и Павел Тонгва, c До Гён Хван, например Санджив Сингх, 9 лет0325 и Он Ван, ф Шри Пракаш Тивари, и Юэ-Лин Лоо, ф Жан-Люк Бредас, и Бернар Киппелен, и Татьяна Тимофеева с а также Сет Р. Мардер* и
Принадлежности автора
* Соответствующие авторы
и Школа химии и биохимии и Центр органической фотоники и электроники, Технологический институт Джорджии, 901 Atlantic Drive NW, Atlanta, GA 30332-0400, USA
Электронная почта: [email protected]
б Институт прикладной физики Академии наук Молдовы, Кишинев, Молдова
с Кафедра химии, Университет Нью-Мексико-Хайлендс, Лас-Вегас, Нью-Мексико, 87701, США
д Университет Сарагосы, 50009Сарагоса, Испания
и Школа электротехники и вычислительной техники и Центр органической фотоники и электроники, Технологический институт Джорджии, 777 Atlantic Drive NW, Атланта, Джорджия 30332-0250, США
ф Кафедра химической и биологической инженерии, Принстонский университет, Принстон, Нью-Джерси 08544, США
г Исследовательский центр управления интерфейсом, Отдел исследований будущей конвергенции, Корейский институт науки и технологий (KIST), Hwarangno 14-gil 5, Seongbuk-gu, Сеул 136-791, Корея